1、综合性实验外周血培养及核型分析,细胞培养技术是目前生命科学研究领域的一项常用而重要的技术，它涉及的技术有：无菌操作技术、细胞分离技术、细胞培养技术、显微摄影技术、图像分析技术等。 Moorhead和Levan等(1960)建立的人体外周血淋巴细胞培养技术，以及Rothrels等(1958)建立的气干法制片技术，成了研究人与哺乳类染色体的最主要技术。,一、实验目的和要求,1、 掌握无菌操作的原理和方法；2、 掌握外周血培养的原理和方法；3、 掌握显微摄影和图象分析的原理和方法；4、 掌握外周血淋巴细胞染色体制备的技术;5、 综合运用已掌握的知识基础和已具备的 实验能力，提高科学研究的综合素质。,
2、二、实验原理,细胞培养是一种程序复杂而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞在体外长期生存，必须模拟体内环境，共给细胞存活所必需的条件。如供给适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖以及有关的生长因子；氧气及适宜的温度；注意调节其外环境的酸碱度（pH）与渗透压；以及为排除细胞代谢产物的危害，保持良好适宜的外环境而进行必需的传代等等。所有这一切条件与操作都要保持在无菌条件下进行。,外周血淋巴细胞是不能增殖的分化细胞群，在体外无菌培养条件下，若于培养基中植物凝集素(PHA)则可刺激处于G。期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，重新有丝分裂的能力，经一段时间的培养即可获得大量分裂期细胞以供染色体分析。秋水仙素(
3、或秋水酰胺)可通过干扰微管组装而抑制纺锤丝形成，使细胞分裂顺利进入后期而停滞于中期，从而可在短期内积累大量最适于进行染色体分中期分裂相。此外，秋水仙素还能使染色单体缩短、分开，使染色体呈现明显形状而利于辨认。,染色体标本制备过程中有两个重要环节， 原理如下：(1)低渗处理：目的是使水分通过细胞膜向细胞内渗入，导致转化的淋巴细胞，染色体进一步分散而利于分析。同时，低渗处理还可使红细胞质膜破裂，经后血影浮于上清中被去除，后续的固定过程主要针对淋巴细胞，改善了淋巴细固定质量及标本质量。(2)固定：目的在于尽快使细胞的结构固定于接近存活的状态，以便作进一步处理，若不固定则可因细胞内蛋白质分解而导致结构
4、变化。染色体研究中常用固定液为甲醇一冰醋酸(3：1)固定液。冰醋酸渗透力强，固定迅速，但易使组织膨胀而甲醇则可使组织收缩，两者混合使用能抵消各自的缺点，得到较好的固定效果。,三、实验用品,(1)器材：冰箱、恒温培养箱、恒温水浴锅、离心机、超净工作台、无菌培养瓶、10ml离心管、显微摄影装置。（2）试剂：RPMI 1640或Eagles MEM培养液、小牛血清(FCS)、PHA、秋水仙素、O075M KCl、甲醇、冰醋酸；肝素、Giemsa、pH68的PBS。（3）材料：动物外周血,四、实验方法（实验操作要点）,(1)采血：用肝素润湿注射针筒(0.2m1)后，常规取静脉血约12ml，转动针筒混匀
5、肝素。（2)接种(在超净工作台中无菌操作)：在每个培养瓶中(含20血清的1640培养液5ml，pH72)，加入全血O25O30ml(7号针头1315滴)、PHA 5mg，盖紧胶塞，轻轻摇匀后。（3)培养：将培养瓶放在37恒温培养箱内培养72 h。终止培养前24 h，加入O01秋水仙素溶液(100gm1)12滴(7号针头)，使终浓度为02gml培养液。轻轻摇匀后，放回培养箱继续培养24h。,(4)收获：将培养后的血细胞收集在离心管中，平衡后1 000rmin离心8 min，弃去上清。（5)低渗：向离心管中加入37 0.075 molL KCl溶液至8ml，用吸管轻轻吹打混匀细胞，置于37水浴箱温
6、育15 min。（6)预固定：向离心管中滴加新配制的甲醇一冰醋酸固定液12 ml，用吸管轻轻吹打混匀后1000rmin离心8min，弃去上清。(7)固定：加入新配制的固定液至8 ml，室温静置30 min。1 000 rmin离心8min，弃去上清。可再重复固定1次。,（8)制片：根据沉淀细胞的多少，加入适量新鲜固定液(O5lml)，轻轻吹打制成细胞悬液。用滴管吸取少量细胞悬液，滴至冰冷的载玻片上，立即甩口。吹散，酒精灯火焰过一下，冷风吹干或气干。(9)染色：1：10 Giemsa染液(pH 68)染色1020 min。流水冲洗，晾干，镜检。（10）摄影分析：选好的分裂相进行显微摄影，并用图象
7、分析软件进行核型分析。,五、实验说明（注意事项）,(1) 无菌操作是培养成败的关键，采血时要注意无菌操作，试剂配置要进行无菌过滤，所用培养器械要进行灭菌处理。(2) PHA添加很重要，如保存不善，效价低或数量不足，则作用差，但浓度过大，红细胞凝块，这些都会影响细胞生长。(3) 秋水仙素用量过大，染色体过度收缩，乃至染色单体离散，用量过小则影响分裂相。(4) 低渗处理极为重要，低渗不够，则染色体聚在一起，分散不好。太过，则造成细胞破碎，染色体丢失。,(5) 离心速度太高，细胞团块不易打散，速度太低，则会丢失细胞。(6) 细胞太多或太少亦能影响分裂相的多少，及标本质量。（7）机械打散细胞团时，用力要适度，若用力过猛，细胞易破碎，染色体不完整。(（8)固定液纯度要高，临用时新鲜配制，应沿管壁慢慢加入后打匀，如果固定液加入太快，会使固定作用过强，染色体扭转；固定液作用不足，染色体出现毛刷状。（9）实验结果要求交一张清晰的显微照片和用相关软件分析的核型图。,六、作业和思考,1、如何有效地做好无菌操作？2、如果分裂相很少，可能的原因是什 么？如何改进？3、如果染色体聚成一团或者染色体太短，原因是什么？如何改进？,
