1、第十单元免疫缺陷性疾病的免疫学检测 实验一 HIV抗体初筛实验获得性免疫缺陷综合征是由人类免疫缺陷病毒（ HIV）感染所引起的以 CD4+ T细胞减少为主要特征，同时伴反复机会感染、恶性肿瘤及中枢神经系统退行性病变的一组综合征。HIV感染的免疫学检验方法主要针对病毒抗原和抗病毒抗体的检测以及免疫细胞数量和功能的分析。HIV抗体初筛实验主要包括酶联免疫吸附试验（ ELISA）、化学发光或免疫荧光试验、快速检测试验（明胶颗粒凝集试验、免疫渗滤试验和免疫层析试验）等。ELISA是最常用的 HIV抗体初筛实验方法。本实验采用双抗原夹心 ELISA法检测人血清中 HIV抗体。检测方法在符合 级生物安全实
2、验室（ BSL-2）要求的艾滋病检测实验室中进行。实验条件将 HIV抗原包被于固相载体，加入待检样品和酶标记的 HIV抗原，形成抗原抗体酶标抗原复合物，洗涤，加底物显色。通过酶标仪检测吸光度 A450nm 值，根据A450nm 值判断 HIV抗体的存在与否。 实验原理1.HIV抗原酶标板。2.洗涤液 PBS-Tween20。 3.辣根过氧化物酶标记的 HIV抗原。4.辣根过氧化物酶底物溶液。5.底物稀释液 PBS-1%BSA 。6.终止液 2mol/l H2SO4溶液。7.对照血清 临床标本筛选获得的阳性血清和阴性血清。8.酶标仪、洗板机。试剂与器材操作步骤编号 ：将样品对应微孔按序编号，每板
3、设阴性对照 2孔、阳性对照 3孔，空白对照 2孔加样 ：分别在相应孔加入待检标本、阴性、阳性对照100l，用封板膜封板后置 37 温育 60min。洗涤 ：用洗板机清洗，在干净滤纸上拍干。加酶 ：每孔加酶结合物 100l（空白对照孔除外），充分混匀，置 37 温育 30min。洗涤 ：用洗板机清洗，在干净滤纸上拍干。显色 ：每孔加入底物缓冲液 50l， TMB 50l，振荡混匀， 37 避光显色 10min。 测定 ：每孔加终止液 50l，振荡混匀。在 450nm波长下，酶标仪测定各孔 A450nm值。结果判断计算临界值：临界值 =阳性对照值 10% 。正常情况下，阳性对照孔的 A450nm值 0.80，样品 A450nm值 临界值者为 HIV抗体阳性。正常情况下，阴性对照孔的 A450nm值 0.08，样品 A450nm值临界值者为 HIV抗体阴性。注意事项实验中设立阳性与阴性对照。底物显色时间不宜过长。注意生物安全。对初筛呈阳性反应的样品，应进行复检试验。如复检均呈阴性，则报告 HIV抗体阴性（ -）；如均呈阳性反应，或一阴一阳，应送 HIV确证实验室进行确证试验。
