1、原发性开角型青光眼MYOC基因C1009缺失突变致病机理的研究,谢小兵 湖南中医药大学第一附属医院,湖南 郴州2012年8月,内容纲要,一、青光眼概述二、原发性开角型青光眼突变 基因筛查三、青光眼致病机理研究 -基因功能研究（细胞/动物水平）,一、青光眼概述,疾病基本特征：病理性高眼压、视神经萎缩、视盘凹陷扩大及进行性视野缺损（视力减退）。病因：尚不清楚，一般认为是由多种因素引起。现认为主要是由遗传和环境因素相互作用所致。,发病情况：是世界上第二大致盲性眼病，仅次于白内障。其分类有多种，其中近一半为原发性开角型青光眼（primary open angle glaucoma，POAG）。2010
2、年全世界有6000多万人患有POAG，其中有450万人会失明。,前房的位置,房水循环示意图,开角型青光眼示意图,闭角型青光眼示意图,前房形态,瞳孔,睫状肌,后房,前房,前房角,小梁网,（Schlemm）,集液管,房水静脉,施莱姆氏管,正常房水循环途径,青光眼的遗传倾向：大量的家系调查发现，约13%47%的开角型青光眼具有家族史，开角型青光眼发病率为2.8%16.4%，远高于正常群体的发病率。青光眼的相关致病基因：目前至少发现7条染色体与POAG相关。MYOC基因是最先确定的与POAG相关的致病基因。,1号染色体：,MYOC基因：,图1 1号染色体结构及MYOC基因结构图,1q2425,已报道的
3、与POAG有关的致病性MYOC基因突变,二、突变基因的筛查,（一）大型原发性开角型青光眼家系调查：,1.该家系共56人，其中男性27人，发病7人，女性29人，发病4人。2.MYOC基因突变筛查 ：RFLP、SSCP法筛查,3.突变蛋白二级结构分析及统计学分析,研究发现在不同地区不同种族POAG的MYOC基因突变现象并不相同，MYOC 90%的基因突变位于第3个外显子。目前较肯定的与青光眼发病有关的突变有: Tyr437His（human)、Tyr423His(mouse) 、 Pro370Leu、 Glu337Arg、Gly357Val等。1. Transgenic Mice Expressi
4、ng the Tyr437His Mutant of Human Myocilin Protein Develop GlaucomaInvest Ophthalmol Vis Sci. 2008 May ; 49(5): 19321939. 2. Expression of Mutated Mouse Myocilin Induces Open-Angle Glaucoma in Transgenic MiceThe Journal of Neuroscience. November 15, 2006, 26(46):1190311914,实验分组： 1. 青光眼家系组(56人） 2. 正常对
5、照组（200例） 入选标准： 体检健康者； 年龄2060岁； 无青光眼家族史； 眼底及眼压检查正常者。,突变筛查：,2琼脂糖凝胶电泳检测产物条带,DNA的提取：外周血用改良NaI法提取模板DNAPCR扩增： 引物设计： MYOC第一外显子：6对引物；PCR产物分别命名为MYOC 16 ； MYOC第二外显子：1对引物；PCR产物命名为MYOC 7 ； MYOC第三外显子：6对引物；PCR产物分别命名为MYOC 813 。 产物鉴定：,PCR产物酶切及突变分析：,PCR-RFLP法共筛查了分布于MYOC基因三个外显子的13个点突变，酶切产物经8PAGE鉴定。,所筛查的突变位点及酶切结果,具体酶切
6、结果如下：1. MYOC 1片段全长174bp，检测出了一个位于第一外显子的新的点突变38CT。未突变片段存在限制性内切酶Asu I的酶切位点，突变后则该酶切位点消失。经该酶消化完全后，可见明显的杂合子条带。该突变存在于家系的4例已确诊病人和1例可疑者中，在对照组中未检出。,MYOC 1片段Asu I酶切结果图 1：家系病人（C,T）杂合子） 2：正常对照组 3： PCR产物 M：DNA marker,2. MYOC 3片段全长189bp，未发生突变时有一个Alw261酶切位点，酶切后片段为93bp和96bp，若发生突变则酶切位点消失。经酶切，发现酶切后片段为93bp、96bp和189bp者3
7、例，为杂合子，由于93bp和96bp两条片段只相差3bp，在8%的PAGE上分辨率比较低，只能观察到重叠影。证实发生了G227T突变。,MYOC 3片段Alw261酶切结果图 1：杂合子 2：纯合子 3：PCR产物 M：DNA Marker,3. MYOC 10片段全长190bp，未发生突变时有2个Bme1390酶切位点，酶切后片段为56bp、61bp和73bp，若发生1009位点突变，则酶切后片段为56bp和134bp。经酶切，发现酶切后片段为56bp和134bp者2例，片段为56bp、61bp、73bp和134bp者10例，存在1009位点C碱基缺失突变。,MYOC 10片段酶切结果图 1
8、：杂合子2：未突变产物 3：纯合子 4：PCR产物 M：DNAMarker,阳性PCR产物测序结果,将根据酶切筛选出的异常结果进行双向测序，测序表明在38位点C变为T，227位点G突变为A，在1009位点发生C碱基缺失。,C38T（Pro13Leu）测序图（箭头所指为杂合子双峰）,G227A(Arg76Lys)测序图,C1009del(Gln377stop)测序图,PCR产物测序结果,统计学分析,在该56人的家系中， 227GA、C1009del 和38CT三种突变筛选情况如下表： 家系中三种突变的筛选情况,结论,1. 本研究在POAG家系中，共发现MYOC基因三个突变,分别是G227A、C1
9、009del和C38T,其中后两个突变为首次发现。2. G227A突变者3例，其中2例为已确诊的POAG病人,1例为家系中表型正常人，对照组中未发现3. C1009del突变者12 例，其中11例已经确诊POAG,在1例4岁的子代亲属中也发现该突变。正常对照组中未发现4. C38T突变存在于4例已确诊的POAG病人和1例可疑者中，正常对照组中未检出。这三个突变的发病率在家系组和正常对照有统计学意义。,FJ237047,（二）蛋白结构的生物信息学分析,进行蛋白质结构分析（蛋白质分析软件Antheprot4.3）,蛋白质一级结构分析 ：1.第227位点的碱基改变GA导致第76位氨基酸由精氨酸变为赖
10、氨酸（Arg76Lys）。,G227A（Arg76Lys）突变前后氨基酸序列对比,2. 第1009位点的C碱基缺失(C1009del)导致终止密码子提前出现,C1009del突变前后氨基酸序列对比,C38T突变前后氨基酸序列对比,3. 对38位C碱基突变为T碱基，导致第13位氨基酸由脯氨酸变为亮氨酸。,G227A（Arg76Lys）突变前后蛋白质二级结构预测（DMP法）,蛋白质二级结构预测分析 1. G227A（Arg76Lys）突变前后，蛋白质结构未发生明显变化,C1009del突变前后蛋白质二级结构预测（DMP法）,2. C1009del突变前后蛋白质二级结构发生了较大变化,C38T突变前
11、后蛋白质二级结构预测对比（DMP法）,3. C38T突变前后： 导致蛋白质的氨基酸序列发生了改变（脯氨酸亮氨酸），但并未造成蛋白质的-螺旋、-折叠、-转角和无规则卷曲等二级结构的明显改变。,G227A（Arg76Lys）突变前后蛋白质理化特性曲线,蛋白质理化特性分析,分析结果：突变前后蛋白质的抗原性、亲水性、疏水性、溶解性等理化性质都未发生明显改变,C1009del突变前后蛋白质理化特性曲线,分析结果：蛋白质的抗原性、亲水性、疏水性、溶解性等理化性质都发生了较大变化。,C38T突变前后蛋白质理化特性曲线对比,分析结果：蛋白质的抗原性、亲水性、疏水性、溶解性等理化性质未发生明显改变。,结论,1.
12、 蛋白质的一级结构分析结果显示 G227A突变 Arg76Lys； C1009del导致氨基酸发生移码突变； C38T突变Pro13Leu2. 蛋白质二级结构分析结果显示G227A突变前后和C38T突变前后，蛋白质的结构和性质未发生明显改变，而C1009del突变前后，蛋白的物理性质发生了明显变化，这些性质变化可能影响了蛋白之间的相互反应，可能与青光眼的发生相关。,MYOC基因突变致病机理？青光眼发生的分子机制？,青光眼,房水循环,三、转基因细胞水平功能研究,（一）RNA干扰技术对MYOC基因C1009del突变小梁细胞模型的构建,流程,1、目的基因RNA干扰慢病毒载体制备,针对目的基因靶序列
13、，利用公用网站按照RNA干扰序列设计原则，设计多个RNA干扰靶点序列，选择最佳靶点；,阳性克隆质粒抽提：琼脂糖凝胶电泳图：,1 号泳道：marker；10 kb，9 kb，8 kb，7 kb，6 kb，5 kb， 4 kb，3 kb，2 kb，1Kb，900 bp，750 bp， 600 bp，500 bp 2、3、4、5号泳道分别代表psc-1、psc-2、psc-3、psc-4质粒载体；6 号泳道代表pscNC（普适性阴参对照）质粒载体。,2、目的基因过表达载体构建,1# ：阴性对照（ddH2O） 2# ：阴性 对照（空载组）3# ：阳性对照（有确定插入片段的载体组）4# ：Marker：
14、 5 kb，3 kb，2 kb，1.5 kb，1 Kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp 。5#-10#为 pEGFP-N1-MYOC,PCR鉴定阳性克隆,使用293T细胞检测融合基因是否表达 因真核表达载体pGFPN1上含有绿色荧光蛋白GFP的基因，当重组融合基因成功转染进入293T细胞后，如果融合基因能够表达，则绿色荧光蛋白也被翻译，从而细胞在荧光显微镜下可显示绿色荧光，故可通过观察绿色荧光的有无来判断融合基因是否表达。,荧光镜检与白光镜下结果 ：,293T细胞荧光镜检结果,293T细胞白光镜检结果,阳性克隆测序,3、Western Blot筛选RNAi有效靶点,构建
15、好含有目的基因的过表达克隆质粒和针对靶基因不同干扰靶点的RNAi病毒载体质粒，共转染培养好的工具细胞（即293T细胞），转染24h荧光显微镜下观测转染效果，转染3648h收集细胞抽提蛋白，采用Western blot检测目的蛋白的表达情况，进而判断不同靶点的干扰效果。,Western Blot 结果扫描 （第一次实验的knockdown检测）,Western Blot 结果扫描 （第二次实验的knockdown检测）,注释：PC：加入pcDNA3.1质粒； NC1：对照组1，不含干扰靶点的敲减质粒； NC2：对照组2，含有紊乱序列的敲减质粒； 1，2，3，4：含有不同干扰靶点的敲减质粒； 0.
16、5g，1.0g：加入的质粒量,（1） 293T细胞共转染实验 （2） Western Blot检测目的基因表达水平,结 论,本实验通过设计并构建4个针对目的基因的4个干扰质粒，通过两次筛靶实验的结果可以看到，1#，2#和3#对MYOC有敲减作用，在两个质粒浓度下的作用基本是一致的。此外，4#也有一些作用，特别是在高浓度下，随机选择3#干扰靶点(PSC 413)进行慢病毒大量包装。,4、检测小梁细胞MYOC基因Knock Down效率,细胞总RNA抽提：RNA逆转录获得cDNAReal-time PCR检测,定量PCR扩增曲线第一次,定量PCR扩增曲线-第二次,结果统计图-第一次,结果统计图-第
17、二次,注： CON:未感染任何病毒的小梁细胞；KL376:感染过表达MYOC慢病毒的细胞；KL376+NC:阴性对照；KL376+KD:感染针对MYOC的RNAi慢病毒的细胞。,统计学分析,Western blot 检测KD效率,准备靶细胞慢病毒感染靶细胞提取感染靶细胞的总蛋白Western blot,从图可见在90KD处出现阳性条带。认为该条带就是目的蛋白的条带。 该图显示：靶点感染组（标注为413）相对阴 性对照组（标注为NC），阳性条带更弱，表明靶点组目的蛋白表达水平下调。因此psc413是有效的RNAi靶点。（CON：未感染过表达MYOC病毒的小梁细胞） 无条带，细胞本底基本不表达MY
18、OC基因，成功构建了小梁细胞模型。,（二） MYOC基因C1009del的定点突变,定点突变技术是蛋白质工程中采用的重要技术之一，它是在已知基因的预定位点通过替换、插入或缺失一定长度的核苷酸片段，精确地改变基因的特定碱基序列，从而研究基因表达调控机制及蛋白质结构与功能的关系，从微观水平上阐述正常状态下基因调控机理及与疾病的关系。,1、构建青光眼相关基因MYOC的C1009del突变,（1） 感受态细胞的制备（2） MYOC基因C1009del突变质粒载体的构建 对阳性菌落的基因用引物EGFP-N-R进行测序分析，其测序结果如下： 测序结果显示成功完成了MYOC基因C1009del的定点突变（3
19、）阳性重组体转化入感受态细胞,2、小梁细胞的培养,小梁细胞：来源于本实验室液氮中的保种细胞。用G418进行细胞筛选 G418 一种氨基糖苷类抗生素。在分子遗传实验中,是稳定转染最常用的抗性筛选试剂。 当neo基因被整合进真核细胞DNA后 ,则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA，从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达，使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长。 G418的这一选择特性，已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。,正常生长的小梁细胞（未用G418筛选前）,阴性对照细胞（未导入突变基因）,含300l/ml G418的培养基中的细胞形态,
20、含400l/ml G418的培养基中的细胞形态,含500l/ml G418的培养基中的细胞形态,含700l/ml G418的培养基中的细胞形态,小梁细胞：来源于本实验室液氮中的保种细胞。 利用不同浓度的G418筛选10天后的单个视野中小梁细胞,在第14天时观察细胞长势，发现G418终浓度： 400l/ml ，小梁细胞全部凋亡，看不到贴壁细胞； =300l/ml，尚有贴壁存活的小梁细胞。 因此，决定400l/ml的G418浓度作为后续筛选导入突变基因的小梁细胞的浓度。,四、动物水平基因功能研究,（一）转基因小鼠模型的构建（1）构建MYOC基因C1009缺失突变过表达载体（2）DNA显微注射,DN
21、A显微注射,1. 促排和取卵：人绒毛膜促性腺激素(hCG)诱导母鼠排卵，和雄鼠合笼，用颈椎脱臼法处死有阴道栓的雌鼠，在解剖镜下找出输卵管伞部，解剖出受精卵。2. 不育雄性公鼠：结扎公鼠 假孕雌性母鼠：在正式实验前，结扎公鼠需与性成熟的雌性小鼠交配，该雌性小鼠为假孕雌性母鼠。 3. 受精卵注射外源DNA：显微操作仪、显微持卵针和显微注射针。4. 注射后的受精卵移植至受孕后0.5天的假孕母鼠的输卵管内,（二）验证转基因小鼠是否为原发性开角型青光眼模型 （1）测定IOP（2）小梁网细胞及视网膜神经节细胞的退行性改变,（三）功能研究,3. 定期测定IOP，分析IOP改变情况4. 分析眼部各组织突变基因
22、mRNA表达情况 包括：角膜、巩膜、视网膜、睫状肌、视神经、房水等。5.分析各组织突变myocilin蛋白表达分布情况 尤其是房水、小梁网细胞内突变蛋白聚集、排列信息6.分析细胞凋亡与视神经节细胞退行性改变的机制。,技 术 路 线 图,（四）近期任务,1、将明确C1009del突变蛋白的功能、房水循环障碍的机制及其与视神经节细胞凋亡之间的关系，进而阐明MYOC突变对POAG发生的致病机理。 2、早期诊断：制备基因芯片，用作症状前诊断或产前诊断，作为家族性青光眼的基因预警手段。3、个体化治疗：提供药物治疗的新靶点，作为个体化治疗的理论基础。,发表的论文及获奖情况,1 Xiaobing Xie,
23、Xin Zhou, Xiying Qu, Jing Wen, Yanli Tian, Fang Zheng.Two novel myocilin mutations in a Chinese family with primary open-angle glaucoma. Molecular Vision, 2008,14:1666-16722 谢小兵，周新，田艳丽，曲喜英，匡多秀，朱惠斌，喻京生，宁兴旺。原发性开角型青光眼家系的 MYOC基因突变研究。中华检验医学杂志，2009，32（2）：157-1613 谢小兵，周新，田艳丽，曲喜英，匡多秀，朱惠斌。原发性开角型青光眼家系中一个新的 MYOC基因突变。中国现代医学杂志，2008，18（14）：2074-20774 匡多秀，李萍，周新，曲喜英，朱昕力，谢小兵(通讯作者)。C1009del突变质粒载体的构建及MYOC基因的有效干扰。国际检验医学杂志，2011, 32（5）:529 5 匡多秀，李萍，谢小兵(通讯作者) 。针对MYOC基因RNAi慢病毒载体的优化及筛选。实用预防医学杂志，2011,18(10):1987-1990 “原发性开角型青光眼家系的MYOC基因突变研究”项目获2008年度中华医学会第七次全国检验医学学术会优秀壁报奖；本课题资助项目：湖南省自然科学基金、湖南省科技厅及教育厅科研资助基金。,谢谢！,
