第二节重组体导入受体细胞的原理与技术.ppt

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资源描述

1、第二节 重组体导入受体细胞的原理与技术,一、重组DNA导入大肠杆菌的方法 二、重组DNA导入真核细胞的方法 三、转化率及影响因素,一、重组DNA导入大肠杆菌的方法,相关概念1.转化(transformation)细菌获得外源质粒DNA,产生新的遗传性状的过程。2.转导(transduction)以噬菌体为媒介,将外源DNA导入细菌的过程。3.转染 (transfection)指感受态的受体细胞捕获和表达以噬菌体为载体的重组DNA分子的过程。转导和转染的区别转导:通过噬菌体(病毒)颗粒感染宿主细胞的途径把外源DNA转移到受体细胞的过程。 转染:噬菌体DNA分子直接导入受体细胞的过程。,(一)转化

2、(transformation),(1)热激法(heat shock),(2)电转化法(electronporation),(3)PEG介导的原生质体转化,(4)接合转化,一、重组DNA导入大肠杆菌的方法,1、化学转化法感受态:细菌能从周围环境中吸收DNA的生理状态称为感受态(competence). 感受态的出现是由于细菌表面出现许多DNA结合位点,这些位点只能与双链DNA结合,而不与单链DNA结合。 这说明完整的双链结构对于转化活性来说是必要的。对于大肠杆菌细胞,一般采用CaCl2溶液来处理受体细胞,增加细胞膜的通透性,制备感受态细胞。,一、重组DNA导入大肠杆菌的方法,一、重组DNA导入

3、大肠杆菌的方法,细菌感受态细胞的制备过程,培养大肠杆菌,OD600至0.3-0.4,On ice 5-10 min,4离心收集菌,用冰冷的60mMCaCl2重悬,4离心收集菌,4离心收集菌,分装、-70 冻存,用冰冷的60mMCaCl2重悬,On ice 30 min,用冰冷的60mMCaCl2重悬,一、重组DNA导入大肠杆菌的方法,重组体导入受体细胞,10ng载体DNA,100L感受态菌,On ice混合,静置30分钟,37摇1小时,10-100L转化液涂含抗菌素的平板,吸附DNA,摄入DNA,加入1mL LB培养基,42C 1.5分钟,热休克法,简单,但转化效率不高(106-108/gDN

4、A)。,一、重组DNA导入大肠杆菌的方法,平板培养基培养细菌,10-100L转化液,涂于含抗菌素的平板,37过夜,一、重组DNA导入大肠杆菌的方法,2.电击转化法 将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中,两极施加高压电场。 在强大电场的作用下,细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙,质粒或DNA重组分子便可进入细胞内 原理: 用高压脉冲电流击破细胞膜或击成小孔,使各种大分子(包括DNA)通过这些小孔进入细胞.,转化效率高(高于109/gDNA),一、重组DNA导入大肠杆菌的方法,LB培养受体菌至OD600=0.5-0.6,冰浴15分钟,2离心集菌,冰冷的水重悬菌体,2 离心集菌,冰冷的

5、水重悬菌体,2 离心收集菌体,少量冰冷的水重悬,分装成 50-300L,电转仪调为2.5kV,25F,脉冲控制器200-400,0.5g质粒DNA,On ice混合,加入1mLSOC培养液,37 中速震荡60分钟,10-100L转化液涂含抗菌素的平板,转化,电击转化法,(二) 转导,由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息的转移过程,(三) 转染,噬菌体DNA不经过蛋白包装成病毒颗粒,直接被感受态细胞捕获的过程。,与转化无本质区别,体外包装好的重组噬菌体感染受体菌,形成噬菌斑。每g DNA能形成106个噬菌斑,现在把DNA转移至动物细胞的过程也称转染,体外包装过程,二、重组DNA导入真核细胞,(一)导

6、入酵母细胞,原生质体转化碱金属离子介导的完整细胞转化PEG1000转化法电击法,(二)导入植物细胞,(三)导入动物细胞,1. 利用原生质体进行转化,酵母,原生质体,感受态,酶去壁,CaCl2 PEG,插入外源基因的载体,转化,转化细胞达原生质体总数的1%2%,转化率受再生率影响共转化的原生质体占转化子总数的25%33%,酵母,0.1mol/L LiCl 处理,感受态,2. 碱金属离子介导的完整细胞转化,热激,涂布选择性平板,筛选转化子,吸收线性DNA能力明显大于环状DNA,两者相差80倍转化率:103个 / g DNA;共转化现象极少,4. 电击转化,(1)适于原生质体和完整细胞(2)转化率高

7、,105个 / g DNA(3)单链转化率高于双链,3. PEG1000转化,PEG处理酵母细胞,可获得类感受态,用于转化,二、重组DNA导入真核细胞,(一)导入酵母细胞,载体介导的转化(农杆菌介导)DNA直接导入(基因抢法、电击法等)种质系统法(花粉管通道法等),(二)导入植物细胞,(三)导入动物细胞,(二)导入植物细胞,1. 农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法,将目的基因插入到载体的T-DNA区,形成重组DNA,(二)导入植物细胞,1. 农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法,将重组DNA转入含有Vir致病基因的农杆菌,(二)导入植物细胞,1. 农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法,通过农杆菌侵染植物

8、外植体,(二)导入植物细胞,1. 农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法,将含有外源目的基因的T-DNA整合到植物细胞基因组中,获得转基因植株,在饲养平皿的滤纸上培养2天,叶盘法的具体操作,又称生物弹击法、微弹轰击法,借助高速金属微粒将DNA分子引入活细胞的转化技术。,金属微粒加速,进入受体细胞,2. 基因枪法(gene gun),基因枪,具体操作,植物细胞,原生质体,纤维素酶和果胶酶,DNA,混合入电击缓冲液,电击处理,愈伤组织,幼苗,分化,3. 电击法(电穿孔法),选择培养,二、重组DNA导入真核细胞,(一)导入酵母细胞,1. 磷酸钙沉淀法2. 脂质体介导法3. 显微注射法4. DEAE-葡萄糖

9、转染法,(二)导入植物细胞,(三)导入动物细胞,原理:,(三)导入动物细胞,1. 磷酸钙沉淀法,通过磷酸钙-DNA共沉淀,将外源基因导入哺乳动物细胞,依据不同的细胞类型,平皿上最多能有10%的细胞能吸收DNA沉淀。,操作简便,成本低廉、可大批量转染、对细胞毒性小、效果稳定,但转染效率低。,2. 脂质体介导法,脂质体包埋DNA,通过细胞膜进入细胞。,脂质体(lipofectin)载体法,应用玻璃显微注射器,直接把外源DNA注射到宿主细胞核里,使其整合到染色体上。,3. 显微注射法,1)外源基因制备:线性化的质粒或目的片段2)收集受精卵:受孕后几小时内3)显微注射:将外源基因注入受精卵的雄原核4)

10、受精卵移植,显微注射法(microinjection),二乙氨乙基(DEAE)葡聚糖为多聚阳离子试剂,能促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。,4. DEAE-葡萄糖转染法,葡聚糖,葡聚糖,DEAE-dextran,外源DNA,细胞,混合,DEAE-dextran对细胞有毒,常采用低浓度长时间处理,吸附到细胞表面后被细胞吞入,部分DNA可以进入到细胞核里。,4. DEAE-葡萄糖转染法,导入外源DNA的几种方法,三、转化率及影响因素,转化率(cfu / gDNA):每微克重组DNA转化后,接纳DNA分子的受体细胞的个数,即阳性克隆数。,(一)转化率的计算:,转化率 产生菌落的总数 / DNA的加入量

11、,三、转化率及影响因素,例:取1l(0.1 ng/l)完整的质粒转化100l的感受态细胞。向转化反应液中加入900l培养液,让细菌恢复一小段时间,取100l铺板。培养过夜,产生1000个菌落,转化率为多少?,转化率1000 / 0.01 ng DNA = 108 cfu /g,三、转化率及影响因素,例:某一DNA重组实验的重组率为20%,转化率为107 cfu / mg 天然载体,经酶切和连接处理后的重组载体转化率比天然载体约低100倍,欲获得104个重组克隆,需要投入多少重组载体DNA进行重组实验?,104 107 cfu / mg 10-2 a 20% 重组载体 a = 0.5 mg,三、

12、转化率及影响因素,普通的亚克隆实验:110 6 cfu/g DNA;更复杂的亚克隆:1107 cfu/g DNA,如有限量的DNA的转化,T-A克隆;构建文库: 1108 cfu/g DNA。,1)载体DNA类型、大小;重组DNA浓度、纯度2)受体细胞3)转化方法:同一转化方法技术参数影响转化率,(二)转化率的影响因素,三、转化率及影响因素,影响转化率的因素 (2)感受态细胞(competent cells) 生长状态制备 感受态菌必须使用对数生长期的菌。 必须在冰冷的条件下制备。 CaCl2处理 要充分,使细菌细胞膜失去一些蛋白。 储存感受态菌要在-70以下 使用感受态菌时必须迅速融化 融化后一般不能再次冻存使用。,

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