1、重组 DNA导入受体细胞1、转化概念转化 ： DNA 重组分子在体外构建完成后，必须导入特定的受体细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组 DNA 分子的转化（ Transformation）。重组 DNA 人工导入受体细胞有许多方法，包括 转化、转染、接合 以及其它物理手段，如受体细胞的电穿孔和显微注射等，这些导入方法在 DNA 重组技术中统称为转化操作。一、重组 DNA转化感受态： 受体细胞最易接受外源 DNA 片段而实现转化的一种特殊生理状态。处于感受态的受体细菌，其吸收转化因子的能力为一般细菌生理状态的千倍以上，而且不同细菌间的感受态差异往
2、往受自身的 遗传特性、菌龄、生理培养条件 等诸多因素的影响。2、细菌转化的步骤：感受态的形成。感受态时细胞表面出现各种蛋白质和酶类，负责转化因子的结合、切割及加工。感受态细胞能分泌一种小分子量的激活蛋白或感受因子，其功能是与细胞表面受体结合，诱导某些与感受态有关的特征性蛋白质（如细菌溶素）的合成，使细菌胞壁部分溶解，局部暴露出细胞膜上的 DNA 结合蛋白和核酸酶等。转化因子的结合。受体菌细胞膜上的 DNA结合蛋白可与转化因子的双链 DNA结构特异性结合，单链DNA或 RNA双链 RNA以及 DNA/RNA杂合双链都不能结合在膜上。转化因子的吸收。双链 DNA 分子与结合蛋白作用后，激活邻近的核
3、酸酶，一条链被降解，而另一条链则被吸收到受体菌中。整合复合物前体的形成。进入受体细胞的单链 DNA 与另一种游离的蛋白因子结合，形成整合复合物前体结构，它能有效地保护单链 DNA免受各种胞内核酸酶的降解，并将其引导至受体菌染色体 DNA处。转化因子单链 DNA的整合。供体单链 DNA片段通过同源重组，置换受体染色体 DNA的同源区域，形成异源杂合双链 DNA结构。二、受体细胞 受体细胞 (receptor cell)： 又称为宿主细胞 (hostcell)，是指能摄取外源 DNA并使其稳定维持的细胞 感受态 (competence)： 是指细菌吸收外源 DNA的生理状态。 感受态细胞 (com
4、petence cell)： 是指具有接受外源 DNA能力的细胞。1、原核生物细胞的优点 大部分原核生物 细 胞没有 纤维 素 组 成的 坚 硬 细胞壁，便于外源 DNA的 进 入。 没有核膜，染色体 DNA没有固定 结 合的蛋白 质 ，这为 外源 DNA与裸露的染色体 DNA重 组 减少了麻 烦 基因 组简单 ，不含 线 粒体和 质 体基因 组 ，便于对 引入的外源基因 进 行 遗传 分析。 原核生物多数 为单细 胞生物，容易 获 得一致性的 实验 材料，并且培养 简单 ，繁殖迅速， 实验 周期短，重复 实验 快。 原核生物 细 胞不具 备 真核生物的蛋白 质 折叠复性系 统 ，即使 许 多
5、真核生物基因得以表达，得到的也多是无特异性空 间结 构的多 肽链 。 原核生物 细 胞缺乏真核生物的蛋白 质 加工系 统，而 许 多真核生物蛋白 质 的生物活性正是依 赖 于其侧链 的糖基化或磷酸化等修 饰 作用。 原核生物 细 胞内源性蛋白 酶 易降解空 间 构象不正确的异源蛋白，造成表达 产 物不 稳 定等。2、原核生物细胞表达真核生物基因存在的缺点：3、被用作受体菌的原核生物：大肠杆菌、枯草杆菌、蓝细菌等。大肠杆菌受体细胞 大肠杆菌属革兰氏阴性菌，它是目前为止研究得最为详尽、应用最为广泛的原核生物种类之一，也是基因工程研究和应用中发展最为完善和成熟的载体受体系统。 优点：繁殖迅速、培养简便，代谢易于控制。 缺点：大肠杆菌细胞间隙中含有大量的内毒素可导致人体热原反应。
