1、第六章,生物氧化 Biological Oxidation,临床生物化学教研室 罗洁讲师,物质在生物体内进行氧化称生物氧化(biological oxidation)，主要指糖、脂肪、蛋白质等在体内分解时逐步释放能量，最终生成CO2 和 H2O的过程。,CO2和H2O,O2,能量,ADP+Pi,ATP,热能,生物氧化的概念,生物氧化与体外氧化之相同点,生物氧化中物质的氧化方式有加氧、脱氢、失电子，遵循氧化还原反应的一般规律。质在体内外氧化时所消耗的氧量、最终产物(CO2，H2O)和释放能量均相同。,反应环境温和，酶促反应逐步进行，能量逐步释放，能量容易捕获，ATP生成效率高。通过加水脱氢反应使
2、物质能间接获得氧，并增加脱氢的机会；脱下的氢与氧结合产生H2O，有机酸脱羧产生CO2。,生物氧化与体外氧化之不同点,生物氧化,体外氧化,能量突然释放。 物质中的碳和氢直接氧结合生成CO2和H2O 。,乙酰CoA,TAC,2H,呼吸链,H2O,ADP+Pi,ATP,CO2,生物氧化的一般过程,第一节 生成ATP的氧化磷酸化体系,The Oxidative Phosphorylation System with ATP Producing,指线粒体内膜中按一定顺序排列的一系列具有电子传递功能的酶复合体，可通过链锁的氧化还原将代谢物脱下的电子最终传递给氧生成水。这一系列酶和辅酶称为呼吸链(respi
3、ratory chain)又称电子传递链(electron transfer chain)。,一、呼吸链,定义,递氢体和电子传递体（2H 2H+ + 2e）,组成,酶复合体是线粒体内膜氧化呼吸链的天然存在形式，所含各组分具体完成电子传递过程。电子传递过程释放的能量驱动H+移出线粒体内膜，转变为跨内膜H+梯度的能量，再用于ATP的生物合成。,（一）氧化呼吸链由4种具有传递电子能力的复合体组成,人线粒体呼吸链复合体,泛醌不包含在上述四种复合体中。,复合体又称NADH-泛醌还原酶。复合体电子传递：NADHFMNFe-S CoQ Fe-S CoQ 每传递2个电子可将4个H+从内膜基质侧泵到胞浆侧，复合
4、体有质子泵功能。,1、复合体作用是将NADH+H+中的电子传递给泛醌(ubiquinone),NAD+和NADP+的结构,R=H: NAD+; R=H2PO3: NADP+,NAD+（NADP+）和NADH（NADPH）相互转变,氧化还原反应时变化发生在五价氮和三价氮之间。,FMN结构中含核黄素，发挥功能的部位是异咯嗪环，氧化还原反应时不稳定中间产物是FMN。在可逆的氧化还原反应中显示3种分子状态，属于单、双电子传递体。,铁硫蛋白中辅基铁硫中心(Fe-S)含有等量铁原子和硫原子，其中一个铁原子可进行Fe2+ Fe3+e 反应传递电子。属于单电子传递体。, 表示无机硫,铁硫蛋白,泛醌（辅酶Q,
5、CoQ, Q）由多个异戊二烯连接形成较长的疏水侧链（人CoQ10），氧化还原反应时可生成中间产物半醌型泛醌。内膜中可移动电子载体，在各复合体间募集并穿梭传递还原当量和电子。在电子传递和质子移动的偶联中起着核心作用。,复合体的功能,复合体是三羧酸循环中的琥珀酸脱氢酶，又称琥珀酸-泛醌还原酶。电子传递：琥珀酸FAD几种Fe-S CoQ复合体没有H+泵的功能。,2、复合体功能是将电子从琥珀酸传递到泛醌。,3、复合体功能是将电子从还原型泛醌传递给细胞色素c。,复合体又叫泛醌-细胞色素C还原酶，细胞色素b-c1复合体，含有细胞色素b(b562, b566)、细胞色素c1和一种可移动的铁硫蛋白(Riesk
6、e protein)。泛醌从复合体、募集还原当量和电子并穿梭传递到复合体。电子传递过程：CoQH2(Cyt bLCyt bH) Fe-S Cytc1Cytc,细胞色素(cytochrome, Cyt),细胞色素是一类以铁卟啉为辅基的催化电子传递的酶类，根据它们吸收光谱不同而分类。,复合体的电子传递通过“Q循环”实现。复合体每传递2个电子向内膜胞浆侧释放4个H+，复合体也有质子泵作用。Cyt c是呼吸链唯一水溶性球状蛋白，不包含在复合体中。将获得的电子传递到复合体。,复合体又称细胞色素C氧化酶(cytochrome c oxidase)。电子传递：Cyt cCuACyt aCyt a3CuBO2
7、Cyt a3CuB形成活性双核中心，将电子传递给O2。每2个电子传递过程使2个H+跨内膜向胞浆侧转移 。,4、复合体将电子从细胞色素C传递给氧,复合体的电子传递过程,细胞色素c氧化酶CuB-Cyta3中心使O2还原成水的过程，有强氧化性中间物始终和双核中心紧密结合，不会引起细胞损伤。,标准氧化还原电位拆开和重组特异抑制剂阻断还原状态呼吸链缓慢给氧,（二）氧化呼吸链组分按氧化还原电位由低到高的顺序排列,由以下实验确定:,呼吸链中各种氧化还原对的标准氧化还原电位,1、NADH氧化呼吸链NADH 复合体Q 复合体Cyt c 复合体O22、琥珀酸氧化呼吸链 琥珀酸 复合体 Q 复合体Cyt c 复合体
8、O2,二、氧化磷酸化将氧化呼吸链释能与ADP磷酸化生成ATP偶联,氧化磷酸化 (oxidative phosphorylation)是指在呼吸链电子传递过程中偶联ADP磷酸化，生成ATP，又称为偶联磷酸化。底物水平磷酸化(substrate level phosphorylation)与脱氢反应偶联，生成底物分子的高能键，使ADP(GDP)磷酸化生成ATP(GTP)的过程。不经电子传递。,ATP生成方式,（一）氧化磷酸化偶联部位在复合体、内,根据P/O比值自由能变化: G=-nFE,氧化磷酸化偶联部位：复合体、,1、P/O 比值,指氧化磷酸化过程中，每消耗1/2摩尔O2所生成ATP的摩尔数（或
9、一对电子通过氧化呼吸链传递给氧所生成ATP分子数）。,2、自由能变化,根据热力学公式，pH7.0时标准自由能变化(G0)与还原电位变化(E0)之间有以下关系：,n为传递电子数；F为法拉第常数(96.5kJ/molV),G0 = -nFE0,电子传递链自由能变化,氧化磷酸化偶联部位,(二)氧化磷酸化偶联机制是产生跨线粒体内膜的质子梯度,1、化学渗透假说(chemiosmotic hypothesis),电子经呼吸链传递时，可将质子(H+)从线粒体内膜的基质侧泵到内膜胞浆侧，产生膜内外质子电化学梯度储存能量。当质子顺浓度梯度回流时驱动ADP与Pi生成ATP。,氧化磷酸化依赖于完整封闭的线粒体内膜；
10、线粒体内膜对H+、OH、K、Cl离子是不通透的；电子传递链可驱动质子移出线粒体，形成可测定的跨内膜电化学梯度；增加线粒体内膜外侧酸性可导致ATP合成，而线粒体内膜加入使质子通过物质可减少内膜质子梯度，结果电子虽可以传递，但ATP生成减少。,化学渗透假说已经得到广泛的实验支持。,化学渗透假说简单示意图,胞液侧,基质侧,电子传递过程复合体 (4H+) 、 (4 H+)和 (2H+)有质子泵功能。,化学渗透示意图及各种抑制剂对电子传递链的影响,（三）质子顺梯度回流释放能量被ATP合酶利用催化ATP合成,F1：亲水部分 （动物：33亚基复合体，OSCP、IF1 亚基），线粒体内膜的基质侧颗粒状突起，催
11、化ATP合成。 F0：疏水部分（ab2c912亚基，动物还有其他辅助亚基），镶嵌在线粒体内膜中，形成跨内膜质子通道 。,ATP合酶结构组成,ATP合酶组成可旋转的发动机样结构,F0的2个b亚基的一端锚定F1的亚基，另一端通过和33稳固结合，使a、b2和33、亚基组成稳定的定子部分。部分和亚基共同形成穿过33间中轴，还与1个亚基疏松结合作用，下端与嵌入内膜的c亚基环紧密结合。c亚基环、和亚基组成转子部分。 质子顺梯度向基质回流时，转子部分相对定子部分旋转，使ATP合酶利用释放的能量合成ATP。,当H+顺浓度递度经F0中a亚基和c亚基之间回流时，亚基发生旋转，3个亚基的构象发生改变。,ATP合酶的
12、工作机制,ATP合成的结合变构机制(binding change mechanism),三、氧化磷酸化作用可受某些内外源因素影响,（一）有3类氧化磷酸化抑制剂,1、呼吸链抑制剂阻断氧化磷酸化的电子传递过程,复合体抑制剂：鱼藤酮(rotenone)、粉蝶霉素A(piericidin A)及异戊巴比妥(amobarbital)等阻断传递电子到泛醌 。复合体的抑制剂：萎锈灵(carboxin)。,复合体抑制剂：抗霉素A(antimycin A)阻断Cyt bH传递电子到泛醌(QN) ；粘噻唑菌醇则作用QP位点。复合体 抑制剂：CN、N3紧密结合中氧化型Cyt a3，阻断电子由Cyt a到CuB- C
13、yt a3间传递。CO与还原型Cyt a3结合，阻断电子传递给O2。,鱼藤酮粉蝶霉素A异戊巴比妥,抗霉素A二巯基丙醇,CO、CN-、N3-及H2S,各种呼吸链抑制剂的阻断位点,不同底物和抑制剂对线粒体氧耗的影响,2、解偶联剂破坏电子传递建立的跨膜质子电化学梯度,解偶联剂(uncoupler)可使氧化与磷酸化的偶联相互分离，基本作用机制是破坏电子传递过程建立的跨内膜的质子电化学梯度，使电化学梯度储存的能量以热能形式释放，ATP的生成受到抑制。 如：二硝基苯酚(dinitrophenol, DNP) ；解偶联蛋白(uncoupling protein，UCP1)。,解偶联蛋白作用机制（棕色脂肪组织
14、线粒体）,Q,胞液侧,基质侧,解偶联 蛋白,3、ATP合酶抑制剂同时抑制电子传递和ATP的生成,这类抑制剂对电子传递及ADP磷酸化均有抑制作用。例如寡霉素(oligomycin)可结合F0单位，二环己基碳二亚胺(dicyclohexyl carbodiimide, DCCP)共价结合F0的c亚基谷氨酸残基，阻断质子从F0质子半通道回流，抑制ATP合酶活性。由于线粒体内膜两侧质子电化学梯度增高影响呼吸链质子泵的功能，继而抑制电子传递。,寡霉素(oligomycin),寡霉素,ATP合酶结构模式图,可阻止质子从F0质子通道回流，抑制ATP生成。,Na+，K+ATP酶和解偶联蛋白基因表达均增加。,（
15、二）ADP 是调节正常人体氧化磷酸化速率的主要因素。,呼吸控制率(respiratory control ratio, RCR),（三）甲状腺激素刺激机体耗氧量和产热同时增加。,（四）线粒体DNA突变可影响机体氧化磷酸化功能。,电子传递链及氧化磷酸化系统概貌,H+ 跨膜质子电化学梯度；H+m内膜基质侧H+；H+c 内膜胞液侧H+,四、ATP在能量的生成、利用、转移和储存中起核心作用,高能磷酸键水解时释放的能量大于21kJ/mol的磷酸酯键，常表示为P。高能磷酸化合物含有高能磷酸键的化合物,一些重要有机磷酸化合物水解释放的标准自由能,肌酸激酶的作用,磷酸肌酸作为肌肉和脑组织中能量的一种贮存形式。
16、,ATP的生成和利用,ATP,ADP,机械能(肌肉收缩)渗透能(物质主动转运) 化学能(合成代谢)电能(生物电)热能(维持体温),生物体内能量的储存和利用都以ATP为中心。,五、线粒体内膜对各种物质进行选择性转运,线粒体外膜通透性高，线粒体对物质通过的选择性主要依赖于内膜中不同转运蛋白(transporter)对各种物质的转运。,线粒体内膜的某些转运蛋白对代谢物的转运,（一）胞浆中NADH通过穿梭机制进入线粒体氧化呼吸链,胞浆中NADH必须经一定转运机制进入线粒体，再经呼吸链进行氧化磷酸化。,-磷酸甘油穿梭(-glycerophosphate shuttle)苹果酸-天冬氨酸穿梭 (malat
17、e-asparate shuttle),转运机制：,1、-磷酸甘油穿梭主要存在于脑和骨骼肌中,NADH+H+,FADH2,NAD+,FAD,线粒体 内膜,线粒体 外膜,膜间隙,线粒体 基质,磷酸二羟丙酮,-磷酸甘油,2、苹果酸-天冬氨酸穿梭主要存在于肝和心肌中,NADH +H+,NAD+,谷氨酸-天冬氨酸 转运体,苹果酸-酮 戊二酸转运体,苹果酸,草酰乙酸,-酮戊二酸,谷氨酸,胞液,线粒体内膜,基质,天冬氨酸,（二）ATP-ADP转位酶促进ADP进入和ATP移出紧密偶联,ATP4-,ADP3-,H2PO4-,每分子ATP4-和ADP3-反向转运时，向内膜外净转移1个负电荷 ，相当于多1个H+转
18、入线粒体基质。,第二节 其他不生成ATP的氧化体系,The Others Oxidative Enzyme Systems without ATP Producing,一、抗氧化酶体系有清除反应活性氧类的功能,反应活性氧类(reactive oxygen species, ROS),ROS主要来源,线粒体：超氧阴离子O-2，是体内O-2的主要来源； O-2在线粒体中再生成H2O2和OH。过氧化酶体：FAD将从脂肪酸等底物获得的电子交给O2生成H2O2和羟自由基OH。胞浆需氧脱氢酶（如黄嘌呤氧化酶等）也可催化生成O-2。细菌感染、组织缺氧等病理过程，环境、药物等外源因素也可导致细胞产生活性氧类。
19、,需氧脱氢酶和氧化酶,抗氧化酶体系,1、过氧化氢酶(catalase)又称触酶，其辅基含4个血红素,可去除细胞生长和代谢产生的H2O2和过氧化物(R-O-OH)，是体内防止活性氧类损伤主要的酶。,2、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx),H2O2 + 2GSH 2 H2O +GS-SG2GSH + R-O-OH GS-SG + H2O + R-OH,谷胱甘肽过氧化物酶,H2O2(ROOH),H2O(ROH+H2O),2G SH,G S S G,NADP+,NADPH+H+,此类酶可保护生物膜及血红蛋白免遭损伤。,谷胱甘肽还原酶,含硒的谷胱甘肽过氧化物酶,3、超氧化物歧化酶,2O2+ 2H+,SOD,H2O2 + O2,H2O + O2,过氧化氢酶,SOD：超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase),二、微粒体细胞色素P450单加氧酶催化底物分子羟基化,上述反应需要细胞色素P450 (Cyt P450)参与。,细胞色素P450单加氧酶(cytochrome P450 monooxygenase)，又称混合功能氧化酶(mixed-function oxidase)或羟化酶(hydroxylase),细胞色素P450单加氧酶作用机制,
