1、,DNA的生物合成(复制)DNA Biosynthesis，Replication,第 十 章,Central Dogma,描述遗传信息流动的方向,1958年 F.crick,逆转录酶,1970年 对中心法则进行了补充,复制(replication)是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板合成子链DNA的过程。,第一节,复制的基本规律Basic Rules of DNA Replication,一、半保留复制的实验依据和意义,子链继承母链遗传信息的几种可能方式,全保留式 半保留式 混合式,密度梯度实验,DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合
2、成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。,半保留复制的概念,按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。,半保留复制的意义,遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。,原核生物复制时，DNA从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。,二、双向复制,A. 环状双链DNA及复制起始点B. 复制中的两个复制叉C. 复制接近终止点(termination, te
3、r),真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon) 。复制子是独立完成复制的功能单位。,真核生物,5,3,3,5,5,3,复制子,3,三、复制的半不连续性,领头链(leading strand),随从链(lagging strand),顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链。另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随从链。复制中的不连续片段称为岡崎片段(okazaki fragment)。 领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。,DNA复制
4、的酶学The Enzymology of DNA Replication,第二节,参与DNA复制的物质,底物(substrate): dNTP聚合酶(polymerase): 依赖DNA的DNA聚合酶， 简写为 DNA-pol模板(template) : 解开成单链的DNA母链(ssDNA）引物(primer): 提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合 其他的酶和蛋白质因子,一、复制的化学反应,(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi,聚合反应的特点,DNA 新链生成需引物和模板； 新链的延长只可沿5 3方向进行 。,二、DNA聚合酶,全称：依赖DNA的DNA聚合酶 (DN
5、A-dependent DNA polymerase,DDDP)简称：DNA-pol,活性：1. 53 的聚合活性2. 核酸外切酶活性,3 5外切酶活性,5 3外切酶活性,?,能切除突变的 DNA片段。,能辨认错配的碱基对，并将其水解。,核酸外切酶活性,（一）原核生物的DNA聚合酶,DNA-pol DNA-pol DNA-pol ,功能：对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。,DNA-pol （109kD）,复制产生短片断的DNA,323个氨基酸,小片段,5 核酸外切酶活性,大片段/Klenow 片段,604个氨基酸,DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性,N 端,C 端,D
6、NA-pol ,Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。,DNA-pol （120kD）,DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。 它参与DNA损伤的应急状态修复。,功能是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。,DNA-pol (250kD),复制产生长片断的DNA,（二）真核生物的DNA聚合酶,DNA-pol ,起始引发，有引物酶活性。,延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。,参与低保真度的复制 。,在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。,在线粒体DNA复制中起催化作用。,DNA-pol ,DNA-pol ,DNA-pol ,DNA-pol ,三、复制
7、保真性的酶学依据,复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。复制保真性的酶学机制：（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读 （二）复制的保真性和碱基选择,（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读,A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。B：碱基配对正确， DNA-pol不表现活性。,（二）复制的保真性和碱基选择, DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。 嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。,1. 遵守严格的碱基配对规律；2. 聚合酶在复制延长时
8、对碱基的选择功能；3. 复制出错时DNA-pol的及时校读功能。,DNA复制的保真性至少要依赖三种机制,四、复制中的分子解链及DNA 分子拓扑学变化,DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。,（一）解螺旋酶和单链DNA结合蛋白,解螺旋酶(helicase)利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链引物酶(primase)复制起始时催化生成RNA引物的酶,单链DNA结合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB)在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整,（二）DNA拓扑异构酶(DNA topoisome
9、rase),解链过程中正超螺旋的形成,拓扑异构酶作用特点既能水解 、又能连接磷酸二酯键,拓扑异构酶 拓扑异构酶,分 类,拓扑异构酶,切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。反应不需ATP。,拓扑异构酶,切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP供能，连接断端， DNA分子进入负超螺旋状态。,作用机制,五、DNA连接酶,连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。,DNA连接酶(DNA ligase)作用方式,HO,5,3,3,5,DNA连接酶,ATP,AD
10、P,5,3,5,3,DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。,功能,（一）复制的起始,需要解决两个问题：,1. DNA解开成单链，提供模板。,2. 合成引物，提供3-OH末端。,一、原核生物的DNA生物合成,E.coli复制起始点 oriC,1. DNA解链,1）复制起始点的识别,2）解螺旋酶解开双链,4）SSB参与维持DNA的单链结构的稳定,3） DNA拓扑异构酶(可能主要是II型酶的作用)，在将要打结或已打结处作切口。,Dna A,Dna B、 Dna C,DNA拓扑异构酶,SSB,3,5,3,5,Dna A,Dn
11、a B、 Dna C,DNA拓扑异构酶,引物酶,SSB,3,5,3,5,2. 引发体的形成,含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。,引物酶,复制是在一段RNA引物的基础上进行的，催化引物合成的是一种RNA聚合酶，它不同于催化转录过程的RNA聚合酶，因此称为引物酶。 DDRP DNA dependent RNA polymerase由于DDDP不可以催化两个单dNTP之间的反应，DDRP可以催化两个NTP起始合成小的RNA片断引物酶合成的小的RNA片断称为“引物”，为DNA的合成提供 3OH,3,5,3,5,引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。,引物,引
12、物酶,复制开始后由于DNA双链解开，在两股单链上进行复制，在电子显微镜下均看到伸展成叉状的复制现象，称为复制叉。 在DNA聚合酶III的作用下，新链第一个脱氧核苷酸就加到引物的3-OH末端上，形成磷酸二酯键。复制开始。,（二）复制的延长,复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。,OH 3,3,领头链的合成：DDDP沿着模板35滑动，第一个进入配对的dNTP与RNA引物上的3OH形成3,5磷酸二酯键，留下3OH继续合成,随从链的合成岡崎片段的形成,两条链是在同一个DNA-pol的催化下进行延长的过程,阶段一,阶段
13、二,阶段三,阶段四,原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。,（三）复制的终止,随从链上不连续性片段的连接,复制过程简图,哺乳动物的细胞周期,DNA合成期,G1,G2,S,M,二、真核生物的DNA生物合成, 细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1S及G2M的调节，与蛋白激酶活性有关。 蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。, 真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。 复制的起始需要DNA-pol（引物酶活性）和pol（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(repl
14、ication factor, RF)。 增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen, PCNA)在复制起始和延长中起关键作用。,（一）复制的起始,3,5,5,3,领头链,3,5,3,5,亲代DNA,随从链,引物,核小体,（二）复制的延长,染色体DNA呈线状，复制在末端停止。复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。,（三）复制的终止,5,3,3,5,5,3,3,5,+,5,3,3,3,3,5,5,端粒(telomere)是指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构部分，通常膨大成粒状。,端粒酶(
15、telomerase),端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR)端粒酶协同蛋白(human telomerase associated protein 1, hTP1)端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTRT),组成,端粒酶的催化延长作用,爬行模型,DNA聚合酶复制子链,进一步加工,端粒维持着染色体的稳定。端粒因细胞分裂而变短到一定程度时，细胞就会死亡。 端粒破损会导致DNA变得脆弱、容易发生变异，可能导致一些与衰老有关的疾病，如动脉硬化和某些癌症。,逆转录和其他复制方式Reverse Transcri
16、ption and Other DNA Replication Ways,第四节,逆转录酶(reverse transcriptase),逆转录(reverse transcription),一、逆转录病毒和逆转录酶,逆转录病毒细胞内的逆转录现象,逆转录酶有三种酶的活性：RNA或DNA作模板的dNTP聚合酶活性和RNase活性,逆转录酶,A A A A,T T T T,AAAA,SI核酸酶,DNA聚合酶,碱水解,T T T T,分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法。,以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链。,试管内合
17、成cDNA,cDNA complementary DNA,逆转录酶,双链DNA,整合,宿主DNA,RNA病毒在细胞内复制成双链的DNA，称为前病毒，前病毒可以独立繁殖在某些条件下，前病毒的基因组通过基因重组，参加到细胞基因组内，并且随着宿主的基因一起复制和表达整合前病毒独立繁殖或者整合，都可成为致病的原因,反转录病毒细胞内的复制,二、逆转录研究的意义,逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。 逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。,滚环复制(rolling circle replicatio
18、n),三、滚环复制和D环复制,是某些低等生物的复制形式，如X174和M13噬菌体等。,3-OH,5-P,5,5,5,3,3,3,3,5,滚环复制,5,5,3,3,5,D环复制(D-loop replication),是线粒体DNA (mitochondrial DNA，mtDNA)的复制形式。,DNA损伤（突变）与修复DNA Damage (Mutation) and Repair,第五节,遗传物质的结构改变而引起的遗传信息改变，均可称为突变。,在复制过程中发生的DNA突变称为DNA损伤(DNA damage)。,从分子水平来看，突变就是DNA分子上碱基的改变。,一、突变的意义,（一）突变是进
19、化、分化的分子基础（二）突变导致基因型改变（三）突变导致死亡（四）突变是某些疾病的发病基础,二、引发突变的因素,物理因素:紫外线(ultra violet, UV)、各种辐射,紫外线照射可引起核酸链上相邻的两个胸腺嘧啶形成二聚体TT（胸腺二聚体）。,化学因素,三、突变的分子改变类型,错配 (mismatch)缺失 (deletion)插入 (insertion)重排 (rearrangement),DNA分子上的碱基错配称点突变(point mutation)。,（一）错配,镰形红细胞贫血病人Hb (HbS) 亚基,正常成人Hb (HbA)亚基,（二）缺失、插入和框移,缺失：一个碱基或一段核苷
20、酸链从DNA大分子上消失。,插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。,框移突变是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。,缺失或插入都可导致框移突变。,缺失引起框移突变,（三）重排,DNA分子内较大片段的交换，称为重组或重排。,由基因重排引起的两种地中海贫血基因型,四、DNA损伤的修复,修复(repairing) 是对已发生分子改变的补偿措施，使其回复为原有的天然状态。,光修复(light repairing)切除修复(excision repairing)重组修复(recombination repairing)SOS修复,修复的主要类型,（一）光
21、修复,光修复酶(photolyase),UV,光修复过程是通过光修复酶催化而完成的，需300600nm波长照射激活,（二）切除修复,是细胞内最重要和有效的修复机制，主要由DNA-pol和连接酶完成。,E.coli的切除修复机制,（三）重组修复,这是DNA的复制过程中所采用的一种有差错的修复方式。,(recombination repairing),DNA分子受到较大范围损伤,使复制受到抑制时这种修复机制用SOS借喻细胞处于危急状态。损伤诱导一种特异性较低的新的DNA聚合酶，以及重组酶等的产生。继续催化损伤部位DNA的复制。通过SOS修复，复制如能继续，细胞是可存活的。然而DNA保留的错误较多，导致较广泛、长期的突变。,（四）SOS修复,
