1、第十五章 细胞工程与作物育种,Chapter 15 Cell Engineering and Crop Breeding,第一节 植物的细胞和组织培养技术第二节 细胞和组织培养与作物育种第三节 植物原生质体培养和体细胞杂交,细胞工程：（plant cell engineering）,以细胞为单位，在体外（in vitro）条件下进行培养、繁殖或人为使细胞的某些生物学特性按人们的意愿生产某种物质的过程。包括花药培养、体细胞变异筛选、幼胚培养、试管受精和原生质体融合等。,理论基础,细胞的全能性（cell totipotency） ： 因为细胞核内有保持物种遗传性所需要的全套遗传物质所以高度分化的体
2、细胞具有发育成一个生物体的能力。,第一节 植物的细胞和组织培养技术,一、培养基及其组成,植物组织培养中常用的培养基主要区别在于无机盐的种类与含量。有的植物生长要求无机盐含量较高,而另一些植物则相反。,（一）培养基的种类和特点,1.MS及其类似的培养基2.硝酸盐含量较高的培养基3.中等无机盐含量的培养基4.低无机盐培养基,1.MS及其类似的培养基,(1)MS培养基（Marshing和Shong，1962 ） MS培养基的无机盐成分对许多种植物均是适宜的。它的无机盐含量和离子浓度较高，微量元素种类较全，养分平衡，浓度也较高。 (2)LS培养基(Linsmainer和SKoog,1965) 其成分是
3、大量元素、微量元素及铁盐,与MS培养基相同,有机物质中仅保留MS培养基的盐酸硫胺素0.4mg/L及肌醇100mg/L,蔗糖3%。,(3)BL培养基(Botton和Lawrene,1968) 成分和MS培养基类似。 (4)BM培养基(Button,1975) 成分与MS培养基类似,仅将盐酸硫胺素除去,蔗糖为3%。 (5)ER培养基(Eriksson,1965) 成分与MS培养基相似。,2.硝酸盐含量较高的培养基,(1)Bg培养基(Camborg等,1968) 它含有较高的硝酸盐和盐酸硫胺素,较低的氨态氮。(2)N6培养基(朱至清等,1975) 成分较简单，KNO3和(NH4)2SO4含量高，广泛
4、用于植物的花药培养。(3)SH培养基(Scken和Hildebrandt,1972) 它是矿质盐浓度较高的培养基,其中铵与磷酸是从NH4H2P04提供的。,3.中等无机盐含量的培养基,(1)H培养基(Bourgin和Nitsch,1967) H培养基大量元素(无机盐)是MS培养基的一半,微量元素种类减少而浓度较MS高,维生素种类则较MS多。(2)Nitsch(1969)培养基 与H培养基成分基本相同,仅生物素较H培养基高10倍。(3)Miller(1963)培养基和Blaydes(1966)培养基 二者成分完全相同,与MS培养基比较,无机元素用量减少1/31/2,微量元素种类减少,无肌醇。,4
5、.低无机盐培养基,(1)White(WH)培养基 无机盐的种类及用量均少于MS培养基,约为MS的1/3。(2)WS培养基(Wolter和SKoog,1966) 适于进行生根培养。(3)HE培养基(Heller,1953) 钾盐和硝酸盐是通过不同的化合物来提供的。(4)改良Nitsch(1951)培养基 常用于花药和胚培养。(5)HB培养基(Holley和Baker,1963)J 用于一些花卉植物(如康乃馨)的脱毒培养效果良好。,（二）培养基的成分,二、培养基的配制,(1)水和药品 水必须采用蒸馏水或无离子水，药品最好采用分析纯，至少是化学纯药品。(2)母液的配置 为方便培养基的制备，现将培养基
6、的各种成份分类配成浓缩的母液，正式配制时按规定用量稀释混合。,(3)制备培养基 (4)培养基的消毒 主要有高温高压灭菌和过滤灭菌两种方法。,三、无菌操作方法,（一）消毒剂消毒剂 使用浓度（%） 消除难易 消毒时间（min） 消毒效果次氯酸钠 2 易 5-30 很好次氯酸钙 9-10 易 5-30 很好过氧化氢 10-12 最易 5-15 好溴水 1-2 易 2-10 很好硝酸银 1 较难 5-30 好氯化汞 0.1-1 较难 2-10 最好抗生素 4-50mg/L 中 30-60 较好,（二）无菌操作 （三）无菌培养,第二节 细胞和组织培养与作物育种,一、体细胞克隆变异及其育种利用,（一）体细
7、胞克隆变异的遗传基础染色体数目变异染色体结构变异点突变,（二）突变体的筛选,（三）在作物改良上的应用抗病抗除草剂抗氨基酸或氨基酸 类似物耐盐耐旱,优良品种,细胞培养,R0,R1群体,改良的体细胞克隆,遗传稳定性测试,育成新品系,区域试验,审定,投入生产,田间试验,多点田间试验,继续田间试验,种子富集,互交测试,确定遗传方式,利用体细胞克隆变异育种的技术路线,二 体细胞变异体和突变体的筛选,体细胞无性系变异：植物体细胞发生的可遗传变异变异体：不加任何选择压力而筛选出的变异个体突变体：经过施加某种选择压力而筛选出的变异个体,有些变异发生在植株的某一部分组织的细胞中，需将这部分变异的细胞从植株上分离
8、下来进行培养，使之再生植株。,1 组织培养之前的变异及其选择,在组培过程中, 对培养物施加某种处理,使之发生变异后再进行选择。,2 组织培养期间的变异及其选择,培养基中不含有特定的选择因子，但含有诱变剂，由此产生的再生植株可能出现优异变异。,3 组织培养后的选择鉴定,4 体细胞无性系选择的几个问题,1) 选择目标的确定,经济性状；基因数目；显隐性,2) 外植体的选择,基因型、器官或组织、年龄,外植体： 用来进行培养的植物的某一部分组织的统称,再生植株由愈伤组织直接分化而成。通常,外植体先形成愈伤组织，再由愈伤组织的一部分形成类似生长锥的分化物，进而发育成幼芽；另一部分愈伤组织则分化成幼根，这两
9、部分进一步发育和联合即形成一个新的植株。,3) 培养系统的选择：,A 器官发生系统：,外植体首先形成愈伤组织，再由愈伤组织分化出类似于种子胚的胚状体，胚状体进一步发育成熟而形成完整植株。,B 胚胎发生系统：,4) 无性系变异的选择,A 在大量无性系中筛选出并发变异少的个体,B 选择两个具有目标性状的无性系杂交，从后代筛选出无不良变异的重组体,三 离体培养技术与植物育种,1 通过胚珠或子房培养与试管受精，克服远缘杂交不亲和性2 使远缘杂种的胚发育成熟3 克服核果类植物胚的后熟作用4 打破种子休眠,四 细胞与组织培养的其他利用途径,1 快速繁殖2 种质保存3 产生无病毒植物材料,第三节 原生质体培
10、养和体细胞杂交,植物原生质体：指用特殊方法脱去细胞壁的、裸露的、有生活力的原生质团。,概 念,一 利用原生质体制造单细胞无性系,二 植物体细胞杂交（原生质体融合）,1） 选择合适的实验材料2） 酶的类型和处理条件：果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶等,1 原生质体的分离与培养,3）原生质体计数,0.25 M NaNO3 和高浓度Ca2+ , 聚乙二醇（PEG）加高浓度Ca2+和高PH值，电融合技术,2 原生质体融合,关键是融合剂的选择：,融合后的细胞类型,3 杂种细胞的鉴别和选择,1)用选择性培养基使杂种细胞有选择性地生长,2) 互补选择法,3)异核体机械分离和 杂种细胞的核型鉴定,4 )杂种和胞质杂种的鉴别,A 花部和营养体的形态观察；B 细胞学检测C 生化鉴定,5）分子生物学分析,A H H H H H H B,思 考 题,如何利用体细胞克隆变异培育新品种？单倍体细胞培养在作物育种中有什么应用价值？细胞和组织培养技术在植物育种中有什么作用？举例说明。,
