1、DNA自动测序自动测序核酸分子杂交核酸分子杂交RNA抽提纯化抽提纯化和逆转录和逆转录 -PCR载体与片段连接、载体与片段连接、感受态细胞转化感受态细胞转化细胞培养及细胞培养及细胞转染细胞转染分子生物学实验培训总结分子生物学实验培训总结质粒抽提和质粒抽提和酶切鉴定酶切鉴定重组 DNA鉴定目的蛋白的表达及功能的研究获得目的基因DNA重组遗传的中心法则遗传的中心法则1958年年 Crick提出以提出以 DNA为中心的遗传信息的传递规律为中心的遗传信息的传递规律，即，即 DNA贮存的遗传信息通过复制传给子代贮存的遗传信息通过复制传给子代 DNA， 通过转通过转录传给录传给 RNA， 再通过翻译传给蛋白
2、质。遗传信息传递方向再通过翻译传给蛋白质。遗传信息传递方向的这个规律被称为。的这个规律被称为。DNA RNA 蛋白质蛋白质复制复制 复制复制转录转录 翻译翻译反转录反转录1970年年 Temin和和 Baltimore发现发现 RNA病毒的病毒的 RNA可通过反转录可通过反转录（逆转录）将遗传信息传给（逆转录）将遗传信息传给 cDNA， 也可通过也可通过 RNA复制或复制或RNA转录传给子代转录传给子代 RNA， 这是对中心法则的补充。这是对中心法则的补充。1997年疯牛病和朊病毒的出现，预示蛋白质也可逆向将遗传年疯牛病和朊病毒的出现，预示蛋白质也可逆向将遗传信息向信息向 DNA传递。传递。？
3、DNA的 结构及功能v DNA分子是由两条反向平行的脱氧核苷酸长链盘绕而成的。v DNA分子中的脱氧核糖和磷酸交替连接，排在外侧，构成基本骨架，碱基排在内侧。v 两条链的碱基通过氢键连接形成碱基对，其中A与 T配对， G与 C配对。v 两个相邻脱氧核苷酸通过 3 -5磷酸二酯键连接。v 起着贮存和传递遗传信息的作用。RNA的种类Categoryv 转运核糖核酸(transfer RNA, tRNA) v 核蛋白体核糖核酸(ribosome RNA, rRNA)v 信使核糖核酸(messenger RNA, mRNA)v 转运氨基酸v 与蛋白质结合形成核蛋白体 ,起装配机的作用v 翻译蛋白质的模
4、板RNA的功能FunctionmRNA的生物合成mRNA Biosynthesisv真核生物的结构基因由内含子和外显子组成，内含子的序列较长，且不编码蛋白质。v真核生物 DNA在转录过程中经剪接可将内含子部分去除，获得成熟的 mRNA。v由于分子生物学研究的最终产物常常是蛋白质，因此我们需要获得可翻译的 mRNA。vmRNA易降解，不易长期保存。v将 mRNA逆转录成 cDNA， 利用 cDNA来研究基因的功能。Trizol提取 RNA原理v Trizol法提取细胞总 RNA是目前常用的提取方法。v 细胞内大部分的 RNA与蛋白质结合在一起，以核蛋白形式存在。 v Trizol内含异硫氰酸胍和
5、苯酚等物质。v 异硫氢酸胍 (GuSCN)是一种强的蛋白质变性剂，不仅能使细胞裂解，同时还能有效地抑制细胞内源性 RNA酶的活性。v 通过有机溶剂的分步抽提，最终可获得纯度较高的细胞总 RNA。RNA提取注意事项 v Trizol试剂含有苯酚，具有毒性和刺激性，注意操作。如皮肤接触 Trizol，请立即用大量水冲洗。 v RNase污染的主要来源是操作过程中手和空气中的浮沉，注意随时勤换手套，样品尽可能盖严；尽量不要对着 RNA样品呼气或说话。用0.01%的 DEPC水浸泡过夜，然后灭菌，烘干。溶液需用 DEPC水配制。v 细胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全会降低最后得率，因为一部分 RNA会残留在未裂解的细胞中。在清洗和裂解细胞时最好在低温下操作，防止在操作过程中释放的内源 RNase降解了 RNA。
