1、碱性磷酸酶标记的链霉亲和素生物素法(SAP法),免疫组织化学实验二,实验材料,1、小鼠胰腺的石蜡切片;2、胰岛素抗体(鼠抗人单克隆抗体);3、SAP检测试剂盒;4、正常羊血清;5、 0.01M PBS(pH7.27.6) ;6、BCIP/NBT显色试剂;7、孵育湿盒。,实验原理,ABC法,SAP法,实验方法或步骤,1、石蜡切片脱蜡至水,蒸馏水洗,PBS浸泡2min;(如需采用 抗原修复,可在此步后进行)。2、10正常羊血清封闭,室温孵育10min;3、倾去血清,勿洗,滴加适当比例稀释的胰岛素一抗或一抗工 作液,37孵育45min。 PBS冲洗,33min;4、滴加生物素标记羊抗鼠IgG工作液,
2、37孵育20min;5、 PBS冲洗,33min;6、滴加碱性磷酸酶标记链霉亲和素工作液,37或室温孵育 20min。 PBS冲洗,33min;7、显色剂显色(BCIP/NBT);8、自来水充分冲洗,封片。,结果,胰岛内可见蓝色或紫蓝色着色的阳性细胞,阳性产物见于细胞质,多聚鳌合物酶法 HRP-多聚化合物-抗体 一、Epos法 Enhanced polymer one-step staining,组织抗原,一抗,HRP,多聚化合物骨架,EPOS 方法,原理:采用一种具有惰性的多聚 化合物作为骨架,将特异 性抗体和HRP,同时标记 在多聚合物分子上,形成 HRP-多聚化合物-特异 性抗体。,步骤
3、:一步法特点:快速,简便,特异性强, 敏感性高 但商品化种类不全, 价格昂贵,二、EnVision法(或PowerVison) Enhanced Labelled Polymer System 原理:HRP -多聚化合物-第二 抗体,组织抗原,一抗,二抗,酶,多聚化合物骨架,第一步,第二步,PowerVision方法,特点:敏感性高:(每个多聚鳌合物中含70个 HRP分子和10 个第二抗体) 特异性强: 复合物内无内源性Avidin和Biotin的干扰。,基本操作步骤,1. 抗原修复2.内源性过氧化 物抑制3. 正常血清封闭,4. 第一抗体5. 多聚骨架复合物6. 显色,实验步骤1、石蜡切片脱蜡至水,PBS洗33min;2、3%H2O2室温孵育10min,以消除内源性过氧化 物酶的活性;蒸馏水洗,PBS浸泡5min;3、滴加适当比例稀释的胰岛素一抗工作液, 37 孵育1hr;4、 PBS冲洗,33min;5、 滴加HRP标记羊抗小鼠Ig多聚体,37或室温孵 育2030min;6、 PBS冲洗,33min; 7、显色剂显色(AEC或DAB);8、自来水充分冲洗,封片。,结果:胰岛内可见棕色着色的阳性细胞,阳性产物见于细胞质。,