1、 小鼠 IL-10 免疫组化试剂盒 该试剂盒以 HRP 标记的链霉亲和素复合物（ HRP Streptavidin Conjugate，HRP-SA）为基础，可用于检测细胞、组织内的特异性 IL-10抗原。该试剂盒具有灵敏度高、特异性强、定性定位准确、背景清晰。在所用的 IL-10 一抗与相应靶抗原结合后，用生物化二抗与一抗特异性结合，最后加入 HRP-SA，形成抗原 特异一抗 生物素化 二抗 HRP-SA 复合物，显微镜下观察成像。 试剂盒所含试剂： 试剂 A 通透液： 0.1% Triton-X 100 10 mL（选用） 试剂 B 封闭缓冲液（封闭用） 20 mL 试剂 C （原装进口分
2、装）已稀释的 即用型 IL-10 一抗 （ 2.5ml） 试剂 D （原装进口分装）生物素化羊抗兔 IgG 1 支 （浓度 1.5 mg/mL，稀释比为 1:3001:500） 50 L +抗体稀释液 20ml 试剂 E HRP-SA 复合物 1 支（浓度 1 M，稀释比 1:501:200） 100 L 试剂 F DAB 显色液 5ml 用户自备试剂： 1 10mM TBS（ pH7.27.4） 三羟基氨基甲烷 1.21g 氯化钠 7.6g 加蒸馏水 800mL，浓盐酸调 pH 值至 7.27.4，最后定容至 1000mL TBS-T： TBS+Tween 20（ 0.05%体积比） 2抗原
3、修复液（依检测抗原不同而选择不同的修复液） 10mM pH6.0 柠檬酸缓冲液 柠檬酸 0.38g 柠檬酸三钠 2.45g 加蒸馏水 900mL，浓盐酸调 pH 值至 6.0，最后定容至 1000mL 或： 0.5M EDTA 修复液（ pH8.0） EDTA2H2O 186.1g 柠檬酸三钠 2.45g 加蒸馏水 700mL，用 10mM NaOH 调 pH 值至 8.0，最后定容至 1000Ml 3. 缓冲甘油封固剂 10 mL 4. Tween 20 5 mL 石蜡包埋组织切片免疫染色 实验步骤（建议方案）： 石蜡包埋组织切片 34 m 厚度 1.烤片： 将待做切片置于切片架上，于 60
4、恒温烤箱中至少烤 1 hr； 2.脱蜡： 切片放入盛有二甲苯的容器中脱蜡 3 次（即二甲苯、），每次10 min； 3.水化： 切片经下行酒精水化，无水乙醇 5min， 95%乙醇 2 次（每次 2min）， 85%乙醇 2 min； 75%乙醇 2min，自来水冲洗， ddH2O 洗 2 2min； 4.抗原修复： 根据抗体说明书推荐方法进行抗原修复，常采用高压、微波（温度达到 98100）或酶消化修复法，室温自然冷却，自来水冲洗， ddH2O 洗 22min， TBS 洗涤（ 2 2min）（具体修复方法见附 1） * 注：有些抗原勿需修复，直接进入第 5 步封闭。 5.封闭： 滴加试剂
5、B， 37湿盒孵育 30 min； 6.加一抗：滴加用试剂 C（即用型 一抗 ） ， 37湿盒孵育 2 hr 或 4过夜； 7.洗涤： TBS-T 洗涤（ 3 5 min）； 8.封闭： 滴加试剂 B， 37湿盒孵育 10 min； 9.加二抗： 滴加用抗体稀释液 稀释的生物素化二抗（试剂 D）， 37湿盒中孵育30 min； 10.洗涤： TBS-T 洗涤（ 3 5 min）； 11.封闭： 滴加试剂 Tween 20， 37湿盒孵育封闭 20 min； 12.加 HRP-SA： 滴加用试剂 C 稀释的试剂 E（ 1： 50200，终浓度 520 nM）， 37湿盒中孵育 30 min； 1
6、3.洗涤： TBS-T 洗涤（ 3 5 min）， TBS 洗涤（ 2 5 min）； 14.显色：应用 DAB 溶液（试剂 F）显色； 15.复染：自来水充分冲洗，复染，脱水，透明； 16.封片： 待组织标本干后，用试剂 缓冲甘油封固剂 封片； 17.观察成像： 显微镜下观察成像。 注意事项： 1. 修复后缓冲液须自然冷却，自来水冲洗后方能把切片取出，骤冷有可能导致结晶或抗原封闭。 2. 缓冲液的量必须保证所有切片都能浸泡到，用过的柠檬酸缓冲液不能反复使用。 3. 若试剂为微量浓缩液 ，用前应低速离心，将内盖和管壁附着的溶液离到底部。 4. 封片前一定要换用 TBS 充分洗涤，以便洗去组织上
7、残留的 Tween 20，否则会影响结果观察。 5. 如须复染细胞核，则在封片前复染或直接采用含有染核试剂的封片剂进行封片。 附 1： 抗原修复方法 常用抗原修复液：柠檬酸缓冲液（ 0.01M pH6.0）、 EDTA 抗原修复液（ pH8.0 或9.0）等等。 一、酶消化修复法 切片脱蜡水化处理， TBS 冲洗，在组织上滴加胃蛋白酶或胰蛋白酶， 37孵育2030min 后 TBS 冲洗即可。 二、微波抗原修复法 微波盒中加入 抗原修复液微波加热至沸腾，将脱蜡水化后的切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，中档或高档继续微波 1015min，取出微波盒冷却至室温后，自来水冲洗，取出切片。因不同微波炉微波处理时间存在差异，须自行调整。 三、直接高压抗原修复法 取修复液于不锈钢高压锅中加热至沸腾，将组织切片置于耐高温切片架上，修复液沸腾后放入切片架，盖上锅盖，待喷气后计时 1.52.5min 即可脱离热源，自然冷却至室温后自来水冲洗，取出切片。此方法适用于较难检测或核抗原的修复。 四、隔水式高压抗原修复法 不锈钢高压锅中加自来 水加热至沸腾，微波盒中加入修复液于微波炉中加热至沸腾，将切片放入微波盒中，再将微波盒放入高压锅中盖上锅盖，待喷气后计时48 min 即可关闭热源，自然冷却至室温后自来水冲洗，取出切片。此方法适用于较难检测或核抗原的修复。
