1、晋 中 学 院本科毕业论文（设计）题 目 鲤鱼鱼皮胶原蛋白 提取工艺的优化 院 系 生物科学与技术 专 业 生物科学 姓 名 赵海燕 学 号 1010111243 学习年限 2010 年 9 月至 2014 年 7 月指导教师 霍建新 职称 副教授 申请学位 理学 学士学位 2014 年 5 月 27 日鲤鱼鱼皮胶原蛋白提取工艺的优化学生姓名：赵海燕 指导老师：霍建新摘 要： 以鲤鱼鱼皮为原料，探索了用胃蛋白酶从鱼皮中提取胶原蛋白的制备技术。对提取过程中选取酶的用量，提取时间，pH 值和温度这 4 个因子对胶原蛋白的提取率进行了比较详细的研究。然后通过正交试验，对实验结论进行讨论与对比，从而可
2、以得出用胃蛋白酶提取鲤鱼鱼皮胶原蛋白的最佳条件是酶的加量为 75Ug-1，提取时间是 8h，pH 值为 2，提取温度为 37。关键词：鲤鱼 胶原蛋白 酶法浸提 胃蛋白酶Study on Enzymatic Hydrolysis of Carp Skin CollagenAuthors Name:Zhao Haiyan Tutor：Huo JianxinABSTRACT： The basic components of carp skin were determined in this study which explore the preparation technology of extra
3、cting collagen from carp skin by pepsin. The process variables were enzyme dosage, extraction time, pH and temperature. In the process of expracting, these four factors on the extaction rate of collagen were studied in detail, then through orthogonal experiment, the experimental conclusions are disc
4、ussed and compared. Collagen hydrolysaces were first gained by pepsin for 8h at temperature(37),pH(2),enzyme dosage (75 u g 1).KEYWORDS：Carp Collagen Enzymatic extraction Pepsin目 录1 前言 .11.1 胶原蛋白的定义 .11.2 胶原蛋白的提取方法 .11.3 胶原蛋白的应用 .21.4 本文研究的内容 .42 鲤鱼鱼皮用酶法提取胶原蛋白的研究 .52.1 实验材料 .52.2 鲤鱼鱼皮的预处理 .52.3 鲤鱼鱼皮
5、胶原蛋白的提取 .52.4 鲤鱼鱼皮提取胶原蛋白的单因素试验 .52.5 鲤鱼鱼皮胶原蛋白提取率的测定 .53 鲤鱼鱼皮用酶法提取胶原蛋白的结果与分析 .63.1 羟脯氨酸标准曲线的绘制 .63.2 胃蛋白酶的用量对胶原蛋白提取率的影响 .73.3 胃蛋白酶的提取时间对胶原蛋白提取率的影响 .83.4 pH 值对胶原蛋白提取率的影响 .83.5 提取温度对胶原蛋白提取率的影响 .93.6 正交试验优化提取条件 .94 讨论 .105 结论 .11参考文献 .11致 谢 .13晋中学院生物科学与技术学院 2014 届本科毕业论文（设计） 01 前言1.1 胶原蛋白的定义胶原蛋白（也称胶原）是细胞
6、外基质的一种结构蛋白质，英文名“collagen”，由希腊文演化而来，多糖蛋白，呈白色，含有少量的半乳糖和葡萄糖，是细胞外基质（ECM ）的主要成分，约占胶原纤维固体物的 85%。胶原蛋白是动物体中普遍存在的一种大分子蛋白，主要存在于动物的结缔组织（骨、软骨、皮肤、腱、韧等）中，占哺乳动物体内蛋白质的 25%30%，相当于体重的 6%。在许多海洋生物，如鱼类的皮，占其蛋白质含量甚至高达 80%以上。除了生物力学方面的以外，还具有诸如信号转导、生长因子与细胞因子的运输等功能。由于氨基酸组成方面的差异，使得鱼皮、鱼鳞、鱼骨中含有的胶原蛋白具有很多在陆生动物中含有的胶原蛋白中没有的特点，例如固定凝胶
7、性、低的粘度性、高度分散性、吸水性、以及乳化性等等，另外人们发现来源于海洋动物的胶原蛋白在一些方面明显优于陆生动物的胶原蛋白，比如具有低的抗原性、低的过敏性、可溶性高、易被蛋白酶水解、变性温度低等特性 1。因此从水产动物中提取胶原蛋白越来越成为一种新的趋势，具有很好的前景。胶原蛋白种类较多，常见类型为型、型、型、型和型，胶原蛋白因具有良好的生物相容性、可生物降解性以及生物活性，比如低抗原性、在体内易被人体吸收、能促进细胞成活与生长、促进血小板凝结等在食品、医药、组织工程、化妆品等领域获得广泛的应用 2。它不仅可以作为保健食品、包装材料和美容产品、还能作为食品添加剂应用在冷冻食品、饮料、糕点和乳
8、制品中。在医学领域中，由于胶原蛋白具有低的免疫原性、生物可降解性、强的机械性纤维和再形成性等优点，可制成人工皮肤胶、原海绵、胶囊等 3。中国传统的胶原保健品“阿胶”主要是以驴皮为原料（其实就是驴皮中所含胶原蛋白） ，经特殊的工艺生产出来的，具有较高的滋补保健作用，有中药三宝之一的美誉。1.2 胶原蛋白的提取方法胶原蛋白提取的目的就是尽量提高胶原蛋白的提取率，并且使所提取的胶原蛋白能够满足不同领域的要求。到目前为止，胶原的提取方法主要有以下 3 种：酸碱法、酶法、热水法 4。1.2.1 酸法提取 酸法主要通过采用低浓度酸性条件处理原料，从而破坏分子间的盐碱，而引起纤维膨胀、溶解。用的酸主要有盐酸
9、、硫酸、醋酸、磷酸、柠檬酸和甲酸等 15。用酸晋中学院生物科学与技术学院 2014 届本科毕业论文（设计） 1浸提法就是提取胶原蛋白十分有效的办法，因为用酸法提取的胶原蛋白能够最大程度的保持其结构。而且此法处理非常快速，所得到的产品分子量还是连续的，适用于医用生物材料和原料的制备，但是产品的得率低，设备腐蚀比较严重，污染严重。户业丽等比较了柠檬酸、醋酸和乳酸提取人工养殖鲟鱼皮胶原蛋白工艺，得出了用 0.5M的柠檬酸提取鱼皮胶原蛋白的的率最高 5。傅燕风等研究了用有机酸对几种淡水鱼皮进行了提取得出了鲢鱼皮、草鱼皮的酸提取以醋酸为最高，鳙鱼鱼皮以柠檬酸为最高6。 1.2.2 碱法提取碱法提取胶原蛋
10、白比较常用的处理剂有石灰、碳酸钠、氢氧化钠等。如 Holzer等采用 1% 1.5%石灰水浸泡的方法来提取胶原蛋白 7。因为它容易造成肽键的水解，所以得到的水解产物就相当低。所以，若想保留胶原蛋白的螺旋结构，此方法不能进行。 1.2.3 热水法提取 热水提取法是将原料经过除杂蛋白等前处理之后，在一定条件下直接用热水浸提已经变性了的胶原蛋白或提胶原蛋白水解物，使用的温度有 100沸水浴、60-70 、40-458。1.2.4 酶法提取 酶法提取是利用某一蛋白酶使胶原蛋白溶解，水解条件要温和，反应速率要快，这样提取的胶原蛋白就具有完整的三螺旋结构，而且纯度高，理化性质稳定，并且无环境污染。酶法提取
11、常用的蛋白酶有：胃蛋白酶、胰蛋白酶。工艺既可以采取一步法，也就是利用酶液直接提取；也可以采取二步法，就是先用酸或者碱进行初步提取，然后再用酶提取。陈小娥等以安康鱼皮为原料，用胃蛋白酶提取胶原蛋白，采用正交试验得到了最佳工艺条件 9。赵苍碧采用胃蛋白酶从牛腱中提取胶原蛋白，研究了酶和酶的用量对提取率的影响，从而算出了酶对胶原蛋白提取率的最佳工艺配比，当酶与牛腱的质量比为 0.1 时效果最好 10。1.3 胶原蛋白的应用1.3.1 胶原蛋白在食品工业上的应用胶原蛋白已我国许多地区销售了多年，并已被确认为一种安全可靠的食品。除了用来生产保健产品，作为一种普通的食品胶原蛋白也有重要的应用。在预防心血管
12、病方面，研究表明，胶原蛋白能够降低胆固醇，并可以使体内某些微量元素维持在一个比较正常的范围内，从而降低血脂。此外，胶原蛋白还能够帮助晋中学院生物科学与技术学院 2014 届本科毕业论文（设计） 2机体排出有害物质，加速血红蛋白和红细胞生成，也可以改善血液循环，同时对冠心病、缺血性脑病有着重要的作用。在作为为人体补钙方面，胶原蛋白作为补钙食品，不是直接补钙的，而是作为血浆中运输钙的工具。除此之外，骨细胞中的胶原蛋白也是黏合剂，它和磷灰石共同形成了骨骼的主体。研究已经表明，机体只有摄入足够多的胶原蛋白时，才能保证机体所补充钙不会流失。其中有一篇写了关于胶原蛋白的文章胶原蛋白可有效改善骨质疏松中特别
13、详细的介绍了胶原蛋白与固钙的关系。在作为食品添加剂方面，胶原蛋白是一种很好的改良剂。当胶原蛋白水解后就形成松散的小分子，同时把它放到肉制品中改善结缔组织的嫩度，增加蛋白质的含量。MeuUenet 等许多人的研究表明，腊肠中胶原蛋白的含量在 2%，水在 20%左右时，腊肠的外观和口感是最好的 11。与其他蛋白质一样的是，胶原蛋白也具有染色性。根据制品的需要，可以用食用色素将腊肠染成接近于肌肉组织的桃红色，使消费者更容易接受。在饮料和乳制品方面，鱼皮中的胶原蛋白是世界上公认的胶澄清剂，它在酒的酿造过程中可以起到增稠剂、乳化剂、稳定剂、澄清剂等等作用。在茶饮料的生产中，明胶可以防止茶饮料长期存放引起
14、的混浊，改善茶饮料品质的目的。胶原蛋白在乳饮料、鲜牛奶、酸奶等乳制品中也有着广泛的应用，并在其中起到抗乳清析出、乳化稳定的功效。同时胶原蛋白也可以加到奶粉中，提高奶粉的营养价值，从而增强奶粉的功能性，加速骨骼发育、增强智力、提高机体的免疫力。在糖果糕点方面，胶原蛋白添加至面包中可延长面包的老化时间，并可以提高面包的体积及面包的松软度。胶原蛋白也具有吸水和支撑骨架的作用，使其微粒溶于水后能相互交织成网状结构，提高糖果的营养价值，并可以开发出低热量的 12。在冷冻食品方面，胶原蛋白因其熔点比较低，易溶于热水中，具有入口即化的特点，所以常被用作粮食胶冻、餐用胶冻、果冻等等。在冰淇淋、雪糕等生产中，胶
15、原蛋白也可以降低融化速度。1.3.2 胶原蛋白在美容方面的应用胶原蛋白中含有许多的蛋白多糖，这些多糖中含有大量的极性基团，是保湿因子，可以阻止皮肤中的酪氨酸转化为黑色素，因此胶原蛋白具有保湿、美白、防皱、祛斑等的作用，可以更快的应用于美容产品中。随着年龄的增长，皮肤中就会缺乏胶原蛋白，皮肤就会失去柔软、弹性和光泽，发生老化，使皮肤出现色斑、皱纹等一系列现象。而将胶原蛋白应用在化妆品中，可晋中学院生物科学与技术学院 2014 届本科毕业论文（设计） 3以抑制黑色素的产生，同时可以促进皮肤组织的新陈代谢，对皮肤产生良好的美白保湿、消皱美容等的作用。1.3.3 胶原蛋白在医学上的应用胶原蛋白是一种肌
16、体自然蛋白，对皮肤表面的蛋白质分子具有比较大的亲和力、比较弱的抗原性、良好的生物相容性，粘着力好。由胶原制成的手术缝合线既有与天然丝一样的高强度，又有可吸收性，在使用时既有优良的血小板凝聚性能，止血效果好，所以胶原蛋白可以作为止血剂。同时用合成材料或胶原蛋白在血浆代用品、人造皮肤、人工血管、骨的修复和人工骨和固定化酶的载体等方面的研究和应用方面都十分的广泛。胶原蛋白分子肽链上具有多种反应基团，如羟基、羧基和氨基等，易于吸收和结合多种酶和细胞，实现固定化，它具有与酶和细胞亲合性好、适应性强的特点。另外，胶原容易加工成型，故纯化的胶原蛋白可制成许多不同形式的材料，如膜、薄片、带、海绵、珠体等，但是
17、以膜形式应用的最多。胶原蛋白制备膜可以用于生物医学，除具有生物可降解性、生物相容性、组织可吸收性、弱抗原性外，还有抗张强度高，亲水性强，透水透气性好等特点，而且官能团多，可进行适度的交联改性，从而可以调节溶解性和控制其生物降解的速度，当同时与其它生物活性组分一起使用时，具有协同效应，也可以与药物相互交联或用酶处理端肽，这样可使抗原性降低，也可以隔离微生物而且还有生物活性 13。同时也存在以下的缺点：胶原分离的胶原交联密度、纤维大小等具有多样性，胶原的分离纯化及加工处理也复杂。酶解胶原蛋白的条件难于控制，速度也多变，而且胶原蛋白干燥后质地也脆，成膜能力还并不强，其膜的延展性低，抗水性差，易干裂，
18、在体内容易降解，遇到水后也容易溶胀，而且在潮湿的环境中易受细菌的侵蚀而变质，同时也可能会导致一些副作用，比如组织钙化等。因此在实际应用中，常常会通过一定的方法首先将胶原蛋白改性，然后提高胶原蛋白的拉伸强度以及抗降解能力，降低膨胀率，改善胶原蛋白的力学性能与抗水性。在临床应用中应用的形式有凝胶、水溶液、海绵、薄膜和颗粒剂等。并且正在研发的胶原蛋白药物缓释药物也都大部分集中在眼科中青光眼和抗感染治疗中，妇科的宫颈发育异常和外科的局部麻醉创伤中的局部治疗以及伤口修复的控制感染等 14。1.4 本文研究的内容鲤鱼俗称鲤拐子，喜欢单独或成小群地生活于平静且丛生的泥底的池塘、湖泊、河流中。杂食性，掘寻食物
19、时常把水搅浑，增大混浊度，对于许多动植物都有不利影响。因此，常被认为是不受欢迎的，人们要花很大力量才能除掉它。但同时它也是淡晋中学院生物科学与技术学院 2014 届本科毕业论文（设计） 4水鱼类中品种最多、分布最广、繁殖历史最悠久、产量最高者之一。其适应性强，耐寒、耐碱、耐缺氧。并且鲤鱼的鱼鳞和鱼皮中含有较多的胶原蛋白 15。因此本实验主要集中研究了用胃蛋白酶提取鲤鱼鱼皮中胶原蛋白的提取条件，从而通过正交试验，找出最佳工艺条件，为胶原蛋白在生物方面、化妆品方面，食品方面等各个方面提供了物质基础，也可以让鲤鱼鱼皮更快的变废为宝。2 鲤鱼鱼皮用酶法提取胶原蛋白的研究2.1 实验材料材料：鲤鱼鱼皮冷
20、冻备用试剂：胃蛋白酶，盐酸，氢氧化钠，蒸馏水等仪器：752N 型紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司） 、温度计等2.2 鲤鱼鱼皮的预处理将鱼皮上剩余的鱼肉切除，然后切成小片，用蒸馏水清洗干净，放在冷冻箱中进行保存 16。2.3 鲤鱼鱼皮胶原蛋白的提取将鲤鱼鱼皮进行预处理后，在 4的条件下，用胃蛋白酶进行浸泡，这样就可以得到胶原蛋白的粗提取液 17。2.4 鲤鱼鱼皮提取胶原蛋白的单因素试验单因素包括酶的用量、提取时间、温度和 pH。基本条件是加酶量 75Ug-1，提取时间为 8h，pH 为 2.0，然后通过各因素分别为 25，50，75，100，125Ug -1，提取时间分别为 4，6
21、，8，10，12h，pH 值分别为 1.2，1.6 ，2.0，2.4，2.8，温度为29，33，37，41，45，每个实验重复三次，然后取平均值。2.5 鲤鱼鱼皮胶原蛋白提取率的测定胶原蛋白中含有大量的甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸等，其中羟脯氨酸在其他蛋白质中较为少见，为胶原蛋白所特有。因此通过羟脯氨酸的含量，就可以得出胶原蛋白的提取率 18。2.5.1 测 定 原 理胶 原 蛋 白 在 浓 酸 的 条 件 下 ， 经 过 高 温 长 时 间 水 解 ， 彻 底 变 成 游 离 的 氨 基 酸 。 其中 的 羟 脯 氨 酸 首 先 用 氯 胺 T 氧 化 生 成 含 吡 咯 环 的 物 质 ， 然
22、 后 以 高 氯 酸 溶 液 除 去 剩 余的 氯 胺 T， 加 入 对 二 甲 基 氨 基 苯 甲 醛 溶 液 作 为 显 色 剂 ， 生 成 红 色 化 合 物 ， 用 可 见 分晋中学院生物科学与技术学院 2014 届本科毕业论文（设计） 5光 光 度 计 ， 在 560nm 处 测 吸 光 度 ， 从 而 得 到 羟 脯 氨 酸 的 含 量 。2.5.2 试 剂 配 制羟 脯 氨 酸 标 准 品 ； 氯 胺 T 溶 液 （ 0.05M） ； 过 氯 酸 （ 3.15M） ； 柠 檬 酸 缓 冲 液（ pH6） ； 对 甲 氨 基 苯 甲 醛 （ 用 乙 二 醇 甲 醚 配 制 ） 。
23、氯 胺 T 不 稳 定 ， 要 现 用 现 配 。2.5.3 标 准 曲 线 绘 制精 密 称 取 干 燥 至 恒 重 的 羟 脯 氨 酸 标 准 品 50.0mg， 用 0.1M 的 HCl 溶 解 并 稀 释 至100mL（ 1mL 相 当 于 500ug） ， 此 为 标 准 储 备 液 。 取 上 述 标 准 储 备 液 2.0mL 加 水 稀 释至 100mL（ 1mL 相 当 于 10ug 羟 脯 氨 酸 ） 即 为 标 准 应 用 液 。取 上 述 标 准 应 用 液 0， 0.2， 0.4， 0.6， 0.8 及 1.0mL， 分 别 置 于 10mL 具 有 塞 刻度 的 试
24、 管 中 用 去 离 子 水 将 各 管 体 积 调 整 为 1.0mL。 然 后 依 次 分 别 加 入 柠 檬 酸 缓 冲 液1.0mL 和 氯 胺 T 液 1.0mL 混 匀 后 放 置 6min。 再 加 过 氯 酸 1.0mL 混 匀 放 置 5min。 各管 加 入 p-DMAB 液 1.0mL 后 ， 混 匀 于 75恒 温 水 浴 中 放 置 10min 迅 速 冷 却 至 室 温 。以 第 一 管 作 空 白 对 照 ， 于 560nm 波 长 测 定 吸 收 度 ， 以 羟 脯 氨 酸 含 量 为 横 坐 标 ， 吸 收度 为 纵 坐 标 绘 制 标 准 曲 线 。2.5.
25、4 样 品 的 制 备 称 取 2g 样 品 于 比 色 管 中 ， 加 入 6N 盐 酸 20mL。 加 塞 密 封 好 后 于 125烘 箱 中 水解 4h， 取 出 后 冷 却 至 室 温 。 用 10molL-1、 1molL-1 的 氢 氧 化 钠 调 节 pH5-7， 过 滤 后 ，滤 液 加 水 稀 释 至 500mL， 使 稀 释 液 中 羟 脯 氨 酸 的 浓 度 在 010gmL-1 范 围 内 。 2.5.5 样 品 测 定精 密 量 取 样 品 供 试 液 200uL 置 于 具 塞 刻 度 试 管 内 ， 加 水 至 1.0mL 后 ， 按 上 述 标准 曲 线 制 备 项 下 ， 自 “加 入 柠 檬 酸 缓 冲 液 1.0mL”起 ， 同 样 操 作 ， 由 测 得 吸 光 度 起 从标 准 曲 线 计 算 样 品 中 羟 脯 氨 酸 含 量 。 以 胶 原 蛋 白 中 羟 脯 氨 酸 含 量 为 13 计 ， 由 此 可得 到 样 品 中 胶 原 蛋 白 的 含 量 。3 鲤鱼鱼皮用酶法提取胶原蛋白的结果与分析3.1 羟脯氨酸标准曲线的绘制测定不同浓度下的羟脯氨酸的 A560 值，以羟脯氨酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制出羟脯氨酸的标准曲线，求出回归方程，结果如下图：
