1、国家高等职业教育畜牧兽医专业教学资源库1饲料中微生物检验一、概述1.饲料微生物检验的意义饲料微生物学检验是饲料品质控制的一个重要方面。正常条件下，饲料中微生物数量有限，但当饲料因加工不当、贮藏不善或因意外事故受到微生物污染时，微生物数量会有大幅度提高，并可有致病性微生物出现。微生物污染饲料后会带来以下几个方面的危害。(1)微生物繁殖过程中产生特殊的颜色和刺激性物质，使饲料具有不良的外观、滋味和气味，影响饲料的适口性。(2)微生物繁殖过程中会消耗大量的营养物质，使饲料营养价值降低。(3)微生物繁殖过程中会产生大量有毒代谢产物，如细菌可产生内毒素或外毒素，霉菌可产生霉菌毒素，因而造成动物细菌毒素或
2、霉菌毒素中毒，并可通过食物链影响人体健康。(4)造成动物细菌性感染或霉菌性感染。(5)扰乱动物消化道正常菌群，破坏动物消化道微生态平衡，使动物出现消化功能紊乱。因此，检测饲料微生物指标，控制饲料微生物数量，对保证饲料卫生安全具有重要点义。2.饲料微生物的种类及形态饲料中常见的微生物主要包括霉菌和细菌。霉菌(mold)并不是生物分类学名称，而是指能在基质上长成绒毛状、棉絮状或蜘蛛网状真菌的俗称，是真菌的一部分。真菌是指有细胞壁、不含叶绿素、无根茎、叶，以寄生或腐生方式生存，仅少数类群为单细胞、其他都有分枝或不分枝的丝状体，能进行有性或无性繁殖的一类生物。真菌的形态有单细胞和多细胞两种类型，霉菌为
3、多细胞类型。在分类学上，霉菌分属于真菌的藻状菌纲(Phycomycets) 、子囊菌纲(Ascomycets)和半知菌类(Fungi Imperfecti)。污染饲料的霉菌主要是曲霉菌属、镰刀菌属和青霉菌属的霉菌，可产生近 200 种霉菌毒素，其中比较重要的国家高等职业教育畜牧兽医专业教学资源库2有黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、杂色曲霉毒素、T-2 毒素、玉米赤霉烯酮、二氢雪腐镰刀菌烯酮、岛青霉素、橘青霉京、黄绿青霉素等。值得注意的是，并非所有的霉菌都能产毒，或者说能产毒的霉菌只是霉菌中的一少部分，同时还应注意，即便是产毒霉菌，也是在其生长到一定阶段才会产毒，并不是在其整个生命期都能产毒。细菌(Ba
4、cterium)是一类具有细胞壁的单细胞微生物。它结构简单，无典型的细胞核，只有核质，无核膜和核仁，不进行有丝分裂，除核蛋白体外无其他细胞器，属原核生物界。细菌的外形有球形、杆形、螺形，分别称为球菌、杆菌、螺形菌(包括弧菌与螺菌)。细菌个体很小，需用显微镜放大数百倍才能看见，一般以 m 作为测量大小的单位。不同种类的细菌大小各异，同一种细菌的大小也可因菌龄和环境因素影响而有所差异。大多数球菌直径约 l m，杆菌长23 m，宽 0.30.5 m。自然界细菌多种多样，饲料中存在的细菌只是自然界细菌的一部分，其中包括致病性、相对致病性和非致病性细菌。它们是评价饲料卫生质量的重要指标之一。3.饲料微生
5、物检验的一般方法目前，饲料微生物学检测主要包括细菌总数检测、大肠杆菌群检测、沙门氏菌检测及霉菌总数检测。饲料细菌总数是指 1g(或 mL)饲料中细菌的个数，但不考虑细菌的种类。细菌总数的高低反映了饲料的清洁程度及对动物潜在的危险性。细菌总数越高，表明饲料卫生状况越差，动物受细菌危害的可能性越大。根据检测计数方法不同，饲料细菌数量有两种表示方法。一种是在严格规定的条件下，经处理的样品直接用平皿培养或经微孔滤器过滤再行培养，使适应培养条件下的活菌细胞必须而且只能生成一个肉眼可见的菌落，根据菌落数计算结果，称为菌落总数；另一种方法是将样品适当处理后，经涂片染色或放入托马氏细胞计数室，在显微镜下对菌体
6、细胞直接计数，其中包括活菌，也包括还未消亡的死菌，称为细菌总数。我国采用前者，即采用营养琼脂培养一菌落计数法测定。因此，我国家高等职业教育畜牧兽医专业教学资源库3们所说的饲料细菌总数实际为菌落总数，即饲料中的活菌数。科学研究证明，大肠菌群都是直接或间接来自于人和温血动物的粪便，因此，如在饲料中检出大肠菌群，表明饲料曾受到过人或温血动物粪便的污染。由于大肠菌群与肠道致病菌来源相同，而且在一般条件下，大肠菌群对外界的抵抗力及在环境中的生存时间与主要肠道致病菌一致，所以，大肠菌群既可作为饲料是否受到人或温血动物粪便污染的标志，也可作为饲料是否受到肠道致病菌污染的指示菌。大肠菌群在环境中广泛存在，饲料
7、中检出大肠菌群，仅说明饲料曾受到过人或温血动物粪便的污染，但并不表示一定有致病菌存在，这存在一个污染程度即菌量问题。大肠菌群污染程度越高，致病菌存在的可能性就越大，因此，我国食品卫生和饮水卫生都对大肠菌群菌量作了严格限制。目前，大肠菌群检测多采用发酵法，即根据大肠菌群的培养特性，运用统计学方法推算出样品中大肠菌群的最可能数(maximum probable number，简写 MPN)。沙门氏菌是重要的肠道致病菌，在饲料中不得检出。饲料中沙门氏菌的检测是根据其生化特性并结合血清学鉴定方法进行的。霉菌总数的检测采用适合霉菌生长而不适宜细菌生长的高渗培养基培养，菌落计数法测定，结果表示的是饲料中的
8、活菌孢子数。霉菌毒素对动物具有强烈的毒害作用，直接检测饲料中的霉菌毒素具有重要意义，但由于霉菌毒素种类繁杂多样，检测过程比较麻烦，有些霉菌毒素还没有理想的检测方法，甚至在某些形变饲料中现在还根本不清楚都存在着哪些霉菌毒素，所以检测饲料霉菌污染程度即霉菌总数就显得非常必要。霉菌毒素是霉菌的有毒代谢产物，饲料霉菌总数越高，饲料受霉菌毒素污染的可能性就越大，同时，考虑到饲料霉变的其他危害，因此，在监测饲料质量及评价其饲用价值时，检测饲料霉菌总数就具有十分重要的意义。饲料微生物检测中，一个重要的原则是无菌观念。从采样、制样到分离培养、生化鉴定等过程都必须坚持无菌操作。二、饲料中细菌总数的检验1.适用范
9、围国家高等职业教育畜牧兽医专业教学资源库4本方法适用于饲料中细菌总数的测定。2.原理将试样稀释至适当浓度，用特定的培养基，在（301）下培养（723）h，计数平板中长出的菌落数，计算 1g 试样中的细菌数量。3.仪器、设备(1)天平：感量为 0.1 g。(2)振荡器：住复式。(3)干热灭菌箱：(50200)1。(4)高压灭菌锅。 (5)冰箱：普通冰箱。(6)恒温箱：(301)。(7)电炉：可调式。(8)平皿：直径为 9 cm。(9)吸管：容量为 1，10 mL。(10)三角烧瓶：容量为 250，500 mL。(11)玻璃珠。 (12)试管：18mm180mm。(13)水浴锅：(461)。(14
10、)酒精灯。(15)试管架。(16)橡皮乳头。4.操作步骤(1)采样。采样时必须特别注意样品的代表性和避免采样时的污染。首先准备好灭菌容器和采样工具，如灭菌牛皮纸袋或广口瓶、金属勺和刀，在卫生学调查基础上，采取有代表性的样品，样品采集后应尽快检验，否则应将样品放在低温干燥处。根据饲料仓库、饲料垛的大小和类型，分层定点采样，一般可分三层五点国家高等职业教育畜牧兽医专业教学资源库5或分层随机采样，不同点的样品，充分混合后取 500 g 左右送检，小量存贮的饲料可使用金属小勺采取上、中、下各部位的样品混合。海运进口饲料采样：每一船舱采取表层、上层、中层及下层 4 个样品，每层从五点取样混合，如船舱盛饲
11、料超过 10000 t，则应加采 1 个样品。必要时采取有疑问的样品送检。(2)试样稀释及培养。无菌称取试样 10.0 g，放入含有 90 mL 稀释液的灭菌三角烧瓶内(瓶内预先加有适当数量的玻璃珠)。经充分振摇，制成 1:10 的均匀稀释掖。最好置振荡器中以 8000l0 000 r/min 的速度处理 23min。用 1 mL 灭菌吸管吸取 1:10 稀释液 1 mL，沿管壁慢慢注入含有 9mL 稀释液的试管内(注意吸管尖端不要触及管内稀释液)，振摇试管，混合均匀，作成1:100 的稀释液。另取一支 1mL 灭菌吸管，按上述操作顺序，作 10 倍递增稀释，如此每递增稀释一次，即更换一支吸管
12、。根据饲料卫生标准要求或对试样污染程度的估计，选择 23 个适宜稀释度，分别在作 10 倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移 1mL 稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。稀释液移入平皿后，应及时将凉至(461)的平板计数用培养基可放置(461)水浴锅内保温注入平皿约 15 mL，小心转动平皿使试样与培养基充分混匀。从稀释试样到倾注培养基之间，时间不能超过 15min。如估计到试样中所含微生物可能在琼脂平板表面生长时，待琼脂完全凝固后，可在培养基表面倾注凉至(461)的水琼脂培养基 4mL。待琼脂凝固后，倒置平皿于(301)恒温箱内培养(723)h 取出，计数平板内菌落数目，菌落数乘
13、以稀释倍数，即得每克试样所含细菌总数。(3)菌落计数方法。作平板菌落计数时，可用肉眼观察，必要时借助于放大镜检查，以防遗漏。在计数出各平板菌落数后，求出同一稀释度两个平板菌落的平均数。国家高等职业教育畜牧兽医专业教学资源库65.菌落计数的报告(1)计数原则。选取菌落数在 30300 之间的平板作为菌落计数标准。每一稀释度采用两个平板菌落的平均数，如两个平板其中一个有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，如片状菌落不到平板的一半，而另一半菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以 2 代表全平板菌落数。(2)稀释度的选择。应选择平均菌落数在 30300 之
14、间的稀释度，乘以稀释倍数报告之。如有两个稀释度，其生长的菌落数均在 30300 之间，视两者之比如何来决定：如其比值小于 2，应报告其平均数；如大于 2，则报告其中较小的数字。如所有稀释度的平均菌落数均大于 300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报情之。如所有稀释度的平均菌落数均小于 30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如所有稀释度均无菌落生长，则以小于()1 乘以最低稀释倍数报告之。如所有稀释度的平均菌落数均不在 30300 之间，其中一部分大于 300或小于 30 时，则以最接近 30 或 300 的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。(3)结果报告。菌落在 100
15、以内时，按其实有数报告；大于 100 时，采用两位有效数字，在两位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算。为了缩短数字后面的零数，也可用 10 的指数来表示。附 7.1 稀释液和培养基制备除特殊规定外，本标准所用化学试剂为分析纯；生物制剂为细菌培养用；水为蒸馏水或无离子水。要求在试验条件下，所用试剂应无抑制细菌生长的物质存在。稀释液成分氯化钠(GB l266) 8.5g；蛋白胨 1.0 g；蒸馏水 1000mL。国家高等职业教育畜牧兽医专业教学资源库7制法将上述成分加热溶解，校正 pH 值使其在灭菌后保持 7.02，按 9mL/支分装于试管，90 mL/瓶分装于三角烧瓶中，塞上棉塞包扎后(12
16、11)高压灭菌 20 min。平板计数用培养基成分蛋白胨 5.0 g；酵母浸膏 2.5 g；无水 D-葡萄糖 1.0g；琼脂 918g；蒸馏水 l000 mL。制法将上述成分加热溶化，校正 pH 值使其在灭菌后保持 7.02。过滤、分装三角烧瓶中，包扎后(1211)高压灭菌 20min。水琼脂培养基成分琼脂 918g；蒸馏水 1000mL。制法加热使琼脂溶化，校正 pH 值使其在灭菌后保持 7.02。分装三角烧瓶中，包扎后(1211)高压灭菌 20min。上述稀释液和培养基如不马上使用，应保存在 05下，时间不超过 1 个月。三、饲料中霉菌的检验1.适用范围本方法适用于饲料中霉菌的检验。2.原
17、理根据霉菌生理特性，选择适宜于霉菌生长而不适宜于细菌生长的培养基，采用平皿计数方法，测定霉菌数。3.设备及材料(1)天平：感量 1g，最大秤量 l000 g。(2)显微镜：1500 倍。(3)温箱：(2528)1。(4)冰箱：普通冰箱。国家高等职业教育畜牧兽医专业教学资源库8(5)高压灭菌器：2.5 kg。(6)干燥箱：(50250)1。(7)水浴锅：(4577)1。(8)振荡器：往复式。(9)微型混合器：2900 r/min。(10)电炉。(11)酒精灯。(12)接种捧：镍铬丝。(13)温度计：(1001)。(14)载玻片。(15)盖玻片。(16)乳钵。(17)试管架。(18)玻璃三角瓶：2
18、50，500 mL。(19)试管：15 mm150 mm。(20)平皿：直径 9cm。(21)吸管：1，10mL。(22)玻珠：直径 5mm。(23)广口瓶：100，500 mL。(24)金属勺、刀等。(25)橡皮乳头。4.培养基和稀释液(1)高盐察氏培养基，见附录 7.2。(2)稀释液，见附录 7.2。(3)实验室常用消毒药品。5.操作步骤(1)采样。采样时必须特别注意样品的代表性和避免采样时的污染。预先准国家高等职业教育畜牧兽医专业教学资源库9备好灭菌容器和采样工具，如灭菌牛皮纸袋或广口瓶、金属勺和刀，在卫生学调查基础上，采取有代表性的样品，样品采集后应尽快检验，否则应将样品放在低温干燥处
19、。根据饲料仓库、饲料垛的大小和类型，分层定点采样，一般可分三层五点或分层随机采样，不同点的样品，充分混合后，取 500 g 左右送检，小量存贮的饲料可使用金属小勺采取上、中、下各部位的样品的混合。海运进口饲料采样：每一船舱采取表层、上层、中层及下层 4 个样品，每层从五点取样混合，如船舱盛饲料超过 10 000t，则应加采一样品。必要时采取有疑问的样品送检。(2)以无菌操作称取样品 25g(或 25mL)放入含有 225 mL 灭菌稀释液的玻塞三角瓶中，置振荡器上，振摇 30 min，即为 1:10 的稀释液。(3)用灭菌吸管吸取 1:10 稀释液 1mL，注入带玻璃珠的试管中，置微型混合器上
20、混合 3min，或注入试管中，另用带橡皮乳头的 1mL 灭菌吸管反复吹吸 50次，使霉菌孢子分散开。(4)取 1:10 稀释液 1 mL，注入含有 9mL 灭菌稀释液试管中，另换一支吸管吹吸 5 次，此液为 1:100 稀释液。(5)按上述操作顺序作 10 倍递增稀释液，每稀释一次，换用一支 l mL 灭菌吸管，根据对样品污染情况的估计，选择 3 个合适稀释度，分别在作 10 倍稀释的同时，吸取 1mL 稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度作两个平皿，然后将凉至45左右的高盐察氏培养基注入平皿中，每皿 15mL 左右，充分混合，待琼脂凝固后，倒置于(2528)1温箱中，培养 3d 后开始观察，应培养
21、观察 1 周。(6)汁算方法。通常选择菌落数在 30100 个之间的平皿进行计数，同稀释度的 2 个平皿的菌落平均数乘以稀释倍数，即为每克( 或每毫升)检样中所含霉菌数。(7)结果报告。每克(或每毫升)饲料中含霉菌数以 个/g（个/mL）表示。附 7.2 霉菌检验用培养基和稀释液制备国家高等职业教育畜牧兽医专业教学资源库10除特殊规定外，所用化学试剂为分析纯或化学纯，生物制剂为细菌培养用，水为蒸馏水。高盐察氏培养基。成分。硝酸钠(GB 636) 2g磷酸二氢钾(GB l274) 1g硫酸镁(MgSO 47H2O，GB 761) 0.5g氯化钾(GB 646) 0.5g硫酸亚铁(GB 664) 0.01g氯化钠(GB l266) 60g蔗糖(HG 3-1001) 30g琼脂 20g蒸馏水 1000 mL制法。加热溶解，分装后，115高压灭菌 30min。必要时，可酌量增加琼脂。稀释液.成分。氯化钠(GB 1266) 8.5g蒸馏水 1000mL 制法。加热溶解，分装后，121高压灭菌 30 min。
