1、卫生毒理学与卫生化学学系2014.11.7,实习一 荧光分析法测定尿中核黄素(VB2)含量,一、实验目的与要求,1、掌握荧光分析法的基本原理及方法。2、掌握固相萃取法对样品进行分离纯化的技术。3、熟悉荧光分光光度计的使用方法。,二、实验原理,核黄素（VB2）在一定波长的光波照射下发荧光。在pH67的溶液中荧光最强，在其它条件恒定时，荧光强度F与VB2浓度C成正比，即F=KC；当pH11时荧光消失。尿中共存物质干扰VB2的测定，需将尿液通过硅镁吸附柱，使其中VB2被硅镁吸附剂吸附，再用洗脱液洗脱，测定洗脱液中VB2的荧光强度。采用标准曲线法进行定量。,三、实验仪器及试剂,仪器与器皿:岛津RF53
2、01型荧光分光光度计，样品池，脱脂棉，吸附柱（内径0.81.0cm，柱长8cm），50ml、1000ml容量瓶，10ml比色管，2ml移液管。,试剂:1）VB2标准贮备液（25mg/L）：准确称取25.0mg核黄素，加400ml双蒸水，加冰醋酸12ml，加热溶解，冷却后转移至1000ml容量瓶中并用双蒸水稀释定容，摇匀，贮存于棕色试剂瓶中。2）VB2标准应用液（0.5g/ml）：取标准贮备液1ml于50ml棕色容量瓶中，用0.1mol/LHAc溶液稀释至刻度，摇匀（现用现配）。3）硅镁吸附剂（60100目）。4）洗脱液：按体积比丙酮：冰醋酸：双蒸水5：2：9。5）0.1mol/L HAc溶液。
3、,四、实验步骤,1、装柱 用一小团脱脂棉将吸附柱管下端轻轻塞住，将1.5g左右的硅镁吸附剂于适量的蒸馏水混合装柱（约占柱长的2/3左右），用双蒸水测试流速，流速控制在6080滴/分，柱内应无气泡。2、标准曲线的绘制（1）吸附：取VB2标准应用液0.00、0.50、1.00、1.50、2.00和2.50ml，分别过柱，用1520ml热水（6070）淋洗柱子。（2）洗脱：将10ml比色管接在柱子下端，每个吸附柱中加入5ml洗脱液，待流尽后再用不足5ml的蒸馏水淋洗柱子，流出液一并盛入比色管中，用双蒸水定容至10ml，混匀，避光保存。,（3）测定取任一标准溶液的洗脱液，固定荧光波长535nm，在35
4、0500nm的波长范围内，测定不同激发光波长下的荧光强度，以激发光的波长为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制激发光谱，选择激发光波长（ex）。固定激发光波长ex，在450600nm的波长范围内，测定不同荧光波长下的荧光强度，以荧光的波长为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制荧光光谱，选择荧光光波长（em）。在固定ex和em的条件下，分别测定不同浓度标准溶液洗脱液中VB2的荧光强度，以VB2的浓度C为横坐标，相对荧光强度F= FF0为纵坐标，绘制标准曲线。,3. 测定样品取尿样5.00ml，通过吸附柱进行吸附、洗脱和荧光测定（方法于上述标准系列相同）。4.结果处理根据测定的样品相对荧光强度Fx= FxF0，从标准曲线上查出样品管对应的VB2浓度，并计算尿中VB2含量。尿中VB2含量（mg/L）= 样品管中VB2浓度10/取尿量,【注意事项】1.操作应在避光条件下进行。2.测定前应用洗脱液通过硅镁吸附剂柱，检查流出液是否有荧光物质。若有，则用丙酮洗硅镁吸附剂，然后烘干待用。3.装柱时要与水混装，以免柱内形成气泡和空隙。【思考题】1.是否能用荧光计代替荧光分光光度计测定荧光光谱和激发光谱？为什么？2.使用荧光分光光度计应注意哪些问题？,谢 谢！,
