1、Comment 1: 与英文关键词一一对应周脂素在糖尿病肾病大鼠肾组织中的表达卫兵艳，樊林花，刘茂林，轩瑞晶，刘田福 （山西医科大学实验动物中心，实验动物与人类疾病动物模型山西省重点实验室，太原 030001）【摘要】目的 观察大鼠糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN)模型的特点和尿LN对早期 DN的诊断价值， 探讨周脂素(perilipin,Plin) 在 DN大鼠肾脏中的表达情况。 方法 将 14只 SD雄性大鼠随机分为对照组（普通饲料）和糖尿病肾病模型组（高糖高脂饲料），对照组 6只，模型组 8只，饲养 4周后模型组按照 30 mg/kg剂量注射 1%链脲佐菌素（S
2、TZ），检测血糖16.7 mmol/L，糖尿病模型制作成功，继续喂养 6周，检测 24 h尿蛋白30 mg/kg，糖尿病肾病模型制作成功。考马斯亮蓝检测 24 h尿蛋白、ELISA测尿层粘连蛋白， HE染色观察肾组织的病理变化，real-time PCR及 western-blot检测肾脏组织中 perilipin表达情况。结果 模型鼠 24 h 尿蛋白30 mg/kg，糖尿病肾病大鼠模型制作成功。和对照组大鼠相比，模型组的肾重/体重比明显增高（P 0.05），尿量、尿层粘连蛋白于 5周出现升高、24 h尿蛋白于 6周时出现升高，且三项指标均随着时间不断增高。肾组织病理检查显示：肾小球肥大,基
3、膜增生, 微小血管瘤形成，肾小管管腔变形，上皮脱落、空泡样变,大量单核、淋巴等炎性细胞浸润，间质内胶原纤维增生。模型组大鼠肾组织 Plin的 mRNA及蛋白表达均明显的升高（P 0.05）。结论 尿层粘连蛋白比 24 h尿蛋白升高得早，可作为早期糖尿病肾病的警示指标。Plin 表达增高可能参与了糖尿病肾病肾病变过程 ，为进一步探讨糖尿病肾病的发病机制提供新的思路。【关键词】 周脂素；尿层粘连蛋白；糖尿病肾病； 24 h尿蛋白; 肾脏；病理学；大鼠 Evaluation of perilipin expression in the kidney tissues of rat model of d
4、iabetic nephropathyComment 2: 名字之间没有连接线Comment 3: 必须有WEI Bingyan, FAN Linhua, LIU Maolin, XUAN Ruijing, LIU Tianfu(Laboratory Animal Center of Shanxi Medical University, Shanxi Key Laboratory of Experimental Animals and Animal Models for Human Diseases, Taiyuan 030001, China)Corresponding author: LI
5、U Tianfu. E-mail: Abstract Objective To characterize the rat model of diabetic nephropathy (DN), to evaluate the diagnostic value of urinary laminin for early detection of DN and to investigate the expression of perilipin in diabetic rat kidneys. Methods Fourteen Sprague-Dawley male rats were random
6、ly divided into a control group (regular diet, six animals) and a diabetic nephropathy model group (high sugar and high fat diet, eight animals). After feeding for 4 weeks, the rats of the disease model group were injected with a dose of 30 mg/kg of 1% STZ. Induction of diabetes was considered succe
7、ssful when blood sugar levels were 16.7 mmol/L. Upon induction of diabetes, animals were fed for an additional 6 weeks. Induction of diabetic nephropathy was considered successful when the 24-hour urinary protein level was 30 mg/kg. Coomassie brilliant blue (CBB) was used to determine the 24-hour ur
8、ine protein levels, ELISA was used to measure urine laminin, and hematoxylin and eosin (H urinary laminin; diabetic nephropathy; 24-hour urine protein; kidneys; pathology; rat【基金项目】 山西医科大学校级青年基金（02201430）。Funded by Shanxi Medical University（02201430）.【作者简介】卫兵艳（1984）女 ,实验师，硕士研究生，研究方向：人类疾病动物模型。Email：
9、【通信作者】刘田福（1954）男，教授，硕士生导师，研究方向：人类疾病动物模型。Email：糖尿病（diabetes mellitus，DM）是以血糖升高为主要特征的代谢综合征，长期持续的高血糖会引发多种并发症，当高血糖累及肾微血管时，出现糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN），DN 是导致 DM患者出现慢性肾功能衰竭（chronic renal failure， CRF）的最主要原因，也是导致 DM患者死亡的首要原因之一 1。 据报道，DM 患者每年约有 10%死于 CRF 2。DN 在早期治疗效果较好，一旦错过最佳治疗时间，将会由大量尿蛋白而发展至尿毒症（uremia
10、 ）、CRF 以至危及患者的生命。故早期诊断DN、明确其发病机制对于预防和治疗 DN有很重要的临床意义。层粘连蛋白（laminin ，LN ）是一种非胶原糖蛋白，表达区域集中在肾小球系膜基质区。有研究发现 DM患者还未出现肾病表现时，尿 LN就有升高，出现肾病时有明显升高 3。因此，检测尿 LN有助于 DN的诊断。周脂素（perilipin，Plin ）也称脂滴相关蛋白，与胰岛素抵抗及脂代谢异常有密切的关系，其在 DM大鼠的肝脏中表达增Comment 7: 微生物级别、品种、数量、体重、月龄，生产许可证号齐全Comment 8: 实验地点及许可证号齐全Comment 9: 体内实验，伦理委员会
11、审批号码齐全Comment 10: 公司和国家齐全高 4，而目前就 Plin在 DN中研究尚未见报道。本实验通过制作 DN大鼠模型，观察尿LN对早期 DN的诊断价值，同时重点研究 Plin在 DN模型中的表达情况，为进一步明确 DN发病机制寻找新思路。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验动物清洁级雄性 SD大鼠 14只，8 10周龄，体重（200 20）g，购自山西医科大学实验动物中心【SCXK( 晋)2015-0001】，饲养于山西医科大学实验动物中心 SPF级环境中【SYXK(晋)2015-0001】。实验操作过程中符合实验动物伦理学要求（伦理审批号：IACUC2018-002）。1
12、.1.2 试剂及仪器高糖高脂饲料（北京科澳力饲料有限公司，D12450B），链脲佐菌素(streptozotocin, STZ, Sigma，S0130），考马斯亮蓝染料（Bio-Rad，1610786），尿 LN ELISA 试剂盒（ Nanjing Senbeijia Biotechnology Co. Ltd.，G01012078），Eastep TM Super Total RNA Extraction Kit（Promega，LS1040 ），GoScript Reverse Transcription Mix Oligo(dT)（Promega，A2790），GoTaq Gpcr
13、Master Mix（Promega ，A6002），Plin抗体（Abcam ，ab66514），Plin 及 -actin引物由大连 TaKaRa 公司合成。荧光定量 PCR仪（QuantStudio 6 Flex，ABI，美国），酶标仪（Epoch，BioTek ，美国），血糖仪及试纸（ACCU-CHEK，Roche，美国），显微镜（ BX51，Olympus，日本），化学发光成像仪（G-Box，Chemi XX9, Syngene，英国）,麻醉机（I-21025 Comerio，Ugo Basile S.R.L，意大利）。1.2 方法1.2.1 制作 DN大鼠模型配置 1%的 STZ溶
14、液：称取 1 g的 STZ溶于 100 mL新配制的 0.2% 构椽酸盐缓冲液中,充分溶解后待用。Comment l11: 前面有“第”，天用汉字表示，其他情况天用 字母 “d”表示Comment 12: 数字与计量单位之间空半格14只雄性 SD大鼠进行随机分组，对照组 6只，喂饲普通维持饲料，模型组 8只，喂饲高糖高脂饲料，在 SPF环境持续饲养 28 d，于第 28天晚上 7点开始空食，12 h后模型组腹腔注射 1% STZ（ 30 mg/kg），对照组腹腔注射等剂量构椽酸盐缓冲液。2 d后刺尾使用血糖试纸检测血糖，血糖值 16.7 mmol/L，且出现多饮、多食、多尿症状的即 DM大鼠模
15、型制作成功。继续维持饲养 42 d，并监测 24 h尿蛋白（每周 1次），当 24 h尿蛋白30 mg/kg，即 DN大鼠模型制作成功。1.2.2 尿液相关指标的检测从第 5周开始，每周固定留取一次 24 h尿标本，记录每次尿量，然后取 5 mL，离心后，取上清测量尿蛋白。空白管加 50 L蒸馏水、标准管加 50 L标准蛋白、样品管加 50 L的上清，每孔再各加 3 mL 考马斯亮蓝 (Coomassie brilliant blue, CBB)，静置5 10 min，595 nm测吸光度值。根据公式计算：尿蛋白浓度= （样品管吸光度值/ 标准管吸光度值） 标准蛋白浓度。尿 LN测定：设空白孔
16、、标准孔、样品孔；标准品按倍比稀释后各加 50 L，取 50 L尿液上清加入样品孔；封板膜封板后，37，30 min；揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加 350 L洗涤液，静置 30 s 后弃去，重复 5次，拍干；每孔加酶标试剂 50 L， 37，30 min；弃液，加 350 L洗涤液，静置 30 s 后弃去，重复 5次，拍干；加显色剂 A 50 L，再加显色剂 B 50 L，轻轻震荡混匀， 37 避光，10 min；加终止液50 L（此时蓝色立转黄色）；15 min 以内酶标仪上空白孔调零，450 nm 波长测 OD值；根据标准曲线计算样品浓度。 1.2.3.肾组织的处理每只鼠称重后，2.
17、5%异氟烷面罩吸入麻醉，仰面固定，剪开腹部，摘下左右两肾。所有大鼠均选左侧肾进行称量，记录重量，之后放入装有 4%中性甲醛离心管中进行固定，48 h后进行石蜡包埋，切片，HE 染色。右肾投入液氮灌中冻存，用于后续的RNA和蛋白提取。1.2.4 Real-time PCR检测肾组织 Plin mRNA水平的表达Comment 13: 统计学表示用差异有显著性或差异无显著性表达Comment 14: 大写，斜体依照 EastepTM Super Total RNA Extraction Kit说明，取冻存肾皮质约 20 mg，提取RNA，酶标仪上检测 RNA的浓度计纯度后，按照 GoScript
18、Reverse Transcription Mix Oligo (dT)说明 进行反转录。最后按照 GoTaq Gpcr Master Mix的说明进行 qPCR，每个样本重复 3次。所用 Plin引物为： Forward primer：5 ,-CGAGTCACAACCCCACGAT-3, Reverse primer:5,-TCAGCCCAGAGAGGAA-3,。反应体系： Forward / Reverse primer 0.4 L、 RNA 2 L 、Mix 10 L、CXR 0.2 L 、ddH 2O 7 L，总体积 20 L。反应条件：9510 min，9515 s，60 1 min
19、，9515 s ，60 15 s，9515 s。1.2.5 Western blot 检测肾组织中 Plin蛋白的表达 提取肾组织总蛋白，BCA 法定量，加入 loading buffer后煮蛋白变性，进行 SDS-PAGE电泳，之后进行湿法转膜将蛋白条带转移至 PVDF膜上，然后洗膜，封闭，一抗孵育过夜（4，80 r/min），二抗孵育 1 h （80 r/min），PBST 洗 3次膜之后进行显影。DAB 显色剂显影，ImageJ 软件对 WB条带定量分析。1.3 统计学方法使用 SPSS 22.0统计学软件对实验数据进行分析，以均数标准差 （x s）来表示均值，采用方差 t 检验，以 P
20、 0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 两组大鼠体重、肾重、肾重/体重的结果将每只大鼠的肾重量和体重进行比值发现：模型组的肾重/体重明显高于对照组的大鼠，差异有显著性（P 0.05）。另外，对比对照组，模型组的大鼠体重明显降低，差异有显著性（P 0.05），结果见表 1。表 1 两组大鼠体重、肾重及肾重/体重的结果（ ）sxTable 1 Body weight, kidney weight and kidney-to-body weight ratios of the two rat groups（ ）sx组别Groups例数n体重Body 肾重Kidney 肾重 /体重比Kidney
21、 weight/body weight Comment l15: 组别放竖栏weight（g） weight（g） ratio （%）模型组Model group 8 255 27.36* 1.24 0.13 0.35 0.06*对照组Control group 6 361 44.37 1.26 0.15 0.46 0.08注：和对照组比较， *P 0.05。Note. Compared with the control group， *P 0.05.2.2 两组大鼠的尿量、24 h 尿蛋白以及尿层粘连蛋白的变化情况相比对照组，在第 5周时，模型组的尿量和尿 LN已经明显升高，差异有显著性（P
22、 0.05），24 h尿蛋白在 6周时开始出现明显增高，差异有显著性（ P0.05）。并且，尿中的这三项指标随时间推移都呈上升趋势，结果见表 2，图 1。表 2 两组大鼠尿量、层粘连蛋白、尿蛋白的变化情况Table 2 Changes of urine volume, laminin and protein content in the two rat groups组别Groups时间Time尿量Urine volume（mL）尿层粘连蛋白Urine laminin（ g/d）尿蛋白Urine protein（mg/d）模型组Model group 39.33 9.21* 6.97 1.88*
23、 12.96 5.43对照组Control group5周5 weeks 11.94 1.30 1.28 0.37 9.33 1.92模型组Model group 49.87 11.36* 9.83 2.35* 25.88 6.13*对照组Control group6周6 weeks 12.67 1.03 1.36 0.29 11.26 2.13模型组Model group 60.45 12.67* 13.71 2.82* 29.93 6.37*对照组Control group7周7 weeks 13.48 4.31 1.41 0.38 11.58 1.76模型组Model group8周8
24、weeks 74.25 10.54* 15.22 2.13* 33.48 5.92*对照组Control group13.89 2.91 1.57 0.46 10.96 1.65模型组Model group82.09 11.68* 16.81 2.79* 39.65 4.78*对照组Control group9 周9 weeks 14.67 3.78 1.65 0.49 12.32 1.04模型组Model group88.34 9.76* 18.93 3.43* 42.93 4.64*对照组Control group10 周10 weeks 15.53 4.51 1.78 0.54 10.8
25、5 2.37注：和对照组比较， *P 0.05， * P 0.01。Note: Compared with the control group， *P 0.05， * P 0.01。A尿量Urinevolume(mL)时间 Time （weeks ）模型组 Model group 对照组 Control groupB尿层粘连蛋白Urinarylaminin(ug/d)时间 Time（weeks）模型组 Model group 对照组 Control groupComment 16: 所有与图相关的均有中英文对照，包括图注及横纵坐标。图上的文字用文本框格式，便于编辑加工处理，统一小 5宋字号。
26、Comment 17: 顺序为中文图注，中文图题，英文图注，英文图题Comment l18: 病理图片需在图题上有放大倍数，并在图片上有比例尺。图 1 两组大鼠的尿量、尿层粘连蛋白以及 24 h尿蛋白的变化Figure 1 Changes in urine volume,laminin and 24-hour urinary protein levels in the two rat groups 2.3 肾病理改变HE染色结果显示：模型组大鼠肾出现典型的病理改变，肾小球肥大,系膜增生，有微小血管瘤形成。肾小管管腔变形，管腔内散在有脱落的上皮细胞，间质内有纤维组织增生，还可见单核、淋巴等炎症细
27、胞浸润，见图 2。图 2大鼠肾组织的病理改变（ 200） Figure 2 Pathological changes of kidney tissues (H&E staining, 200)2.4 肾组织 Plin mRNA的检测结果对照组 Control group 模型组 Model groupC尿蛋白Urineprotein（mg/d）时间 Time（weeks）模型组 Model group 对照组 Control group模型组肾组织 Plin 的 mRNA 表达明显升高，是对照组的 （3.26 0.37） 倍，差异有显著性( P 0.05)，见图 3 。图 3 大鼠肾 Plin
28、 的 qPCR 检测结果Figure 3 Expression of Plin mRNA in the rat kidneys detected by qPCR.2.5 两组大鼠肾组织 Plin 蛋白 Western blot 检测结果模型组 Plin 蛋白表达明显升高，是对照组的（2.98 0.59）倍，差异有显著性（P 0. 05），见图 4。对照组Control group模型组Model group周脂素mRNA表达ThemRNAexpressionofplin对照组Control group模型组Model group周脂素蛋白表达 Plinprotein/-actin-actinPlin对照组Control group模型组Model group group
