1、第十 节蛋白质蛋白质的分离与纯化的分离与纯化一、 引言二、 蛋白质（酶）分离纯化的前处理三、蛋白质（酶）分离与纯化四、层析技术五、电泳技术六、离心技术四、层析技术 层析法也称色谱法，是 1906年俄国植物学家 Michael Tswett发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为 “色谱法 ”（Chromatography) 。 后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。 1944年出现纸层析。 以后层析法不断发展，相继出现薄层层析、气相层析、高压液相层析、亲和层析、凝胶层析等。（一）层析的分类 按层析的分离机理分类 排阻层析
2、 (exclusion chromatography) 离子交换层析 (ion exchange chromatography) 吸附层析 (absorption chromatography) 分配层析 (partition chromatography) 亲和层析 (affinity chromatography) 金属螯合层析 (metal chelating chromatography) 疏水层析 (hydrophobic chromatography) 反向层析 (reverse phase chromatography) 聚焦层析 (focusing chromatography
3、) 灌注层析 (perfusion chromatography)（二）排阻层析 （凝胶层析）凡是利用生物大分子的相对分子质量差异进行层析分离的方法，均称之为排阻层析。用于层析的分离介质称为排阻层析介质。凝胶层析介质主要是以葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等为原料，通过特殊工艺合成的层析介质。目前已成为生物化学、分子生物学和生物制药的研究和生产中必不可少的分离介质。 1、凝胶层析的特点及应用 特点：设备简单、操作方便、样品回收率高、实验重复性好、特别是不改变样品生物学活性等优点。 用途：蛋白质 (包括酶 )、核酸、多糖等生物分子的分离纯化，同时还应用于蛋白质分子量的测定、脱盐、样品浓缩等。2、凝胶层
4、析的原理凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。概念（ 排阻层析，分子筛层析）：当生物大分子通过装有凝胶颗粒的层析柱时，根据它们分子大小不同而进行分离的技术。原理： 凝胶颗粒内部具有多孔网状结构 ， 被分离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。3. 凝胶的种类和性质(1)交联葡聚糖凝胶（ Sephadex)1) Sephadex G G 后的数字为凝胶吸水值的 10倍。G 反应凝胶的交联程
5、度、膨胀程度和分部范围。2） SephadeX LH 20， 是 Sephadex G 25的羧丙基衍生物，溶于水和亲脂性溶剂，用于分离不溶于水的物质 。(2)琼脂糖凝胶（ Sepharose ; pharmacia;Bio-Gel(Blo-Rad)依靠糖链之间的次级键维持网状结构，琼脂糖密度越大，网状结构越密集。(3)聚丙烯酰胺一种人工合成的凝胶，以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联而成。交联剂越多，孔隙度越小。商品名为生物胶 P（ Bio-Gel P).(4) 聚丙乙烯凝胶（ Styrogel) 大网孔结构。葡聚糖凝胶 (Sephadex )的物理特性品 名 干胶 颗粒直径 /m得水 值
6、Wf/g.g-1床体积/mL.g-1最适分段分离范 围 溶 胀 所需时间 /h 最大流体 静力 压/Pa(cmH2O)球蛋白分子 质 量 Da 线 性葡聚糖分子 质 量/Da20 lOOSephadex G-1O 40-120 1.0 0.1 2-3 700 700 3 1 9810(100)Sephadex G-15 40-120 1.5 0.2 2.5-3.5 1500 1500 3 1 9810(100)SephadexG-25粗中粗细超 细100-30050-15020-8010-402.5 0.2 4-6 1000-5000 100-5000 6 2 9810(100)Sephade
7、xG-50粗中粗细超 细100-30050-15020-8010-405.0 0.3 9-11 1500-30000 500-10000 6 2 9810(100)Sephadex G-75中粗超 细40-12010-40 7.5 0.5 12-15 3000-70000 1000-50000 24 3 4905(50)Sephdex G-100中粗超 细40-12010-40 10 l.0 15-20 4000-150000 1000-100000 48 5 3434(35)SephadexG-150中粗超 细40-12010-40 15 1.5 20-30 5000-400000 1000-150000 72 5 1472(15)Sephadex G-200中粗超 细40-12010-40 20 2.0 30-40 5000-800000 1000-200000 72 5 981(10)
