1、1引物设计的原理和程序一、设计原理1、选择合适的靶序列：设计引物之前，必须分析待测靶序列的性质，选择高度保守、碱基分布均匀的区域进行引物设计。2、长度：一般来说，寡核苷酸引物长度为 15-25bp。3、Tm 值：引物的 Tm 值一般控制在 55-65，尽可能保证上下游引物的 Tm 值一致。若 G+C 含量相对偏低，则可以使引物长度稍长，而保证一定的退货温度。4、G+C 含量：有效引物中的 G+C 含量一般为 40%-60%。5、碱基的随机分布：引物中四种碱基的分布最好是随机的，不存在聚嘌呤和聚嘧啶，尤其在引物的 3端不应超过 3 个连续的 G 或 C。6、引物末端：只有引物的 3端与模板结合，
2、PCR 才能进行，所以 3端最好是 G 或C。7、引物自身：引物自身不存在连续 4 个碱基以上的互补序列，否则会影响到引物与模板之间的结合，尤其避免 3端的互补。8、引物之间：上下游引物之间尽量少的存在互补序列，否则上下游引物退火结合，将影响到 PCR 的扩增效率。二、序列查找根据所需检测的待检定基因，在http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide&itool=toolbar网址查询有关序列。三、引物设计与筛选以 Beacon Designer 5.1 软件为例，进行引物设计和筛选。1、打开软件，调入序列22、选择序列文件名，加入右框3、序列显示如图，4、选择引物设计方式35、点击“Primer Search（图标 ） ”，按照引物设计的原理，设定引物的各种参数，点击“Search”进行引物搜寻6、等待引物搜寻，显示结束后，点击“OK” ，进入下一页，47、按照搜寻结果显示，逐条分析， 点击“All Structures”，检查该引物对的二级结构，依次筛选四、引物比对比对设计的引物是否满足需要和引物的特异性，在http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/网址进行比对1、输入所需比对的序列，选择数据库“nr”52、点击“Blast” ，进入下一页3、点击“Format” ，进入比对结果
