1、单克隆抗体制备实验单克隆抗体制备实验Caspar Gu2019-4-12目 录 实验目的实验原理实验材料实验步骤注意事项一、 实验 目的a. 了解并掌握单克隆抗体的制备原理； b. 熟悉单克隆抗体的制备过程；c. 熟练掌握无菌操作技术。二、 实验 原理1975年 Kohler和 Milstein发现 将小鼠骨髓瘤 细 胞与和 绵 羊 红细 胞免疫的小鼠脾 细 胞 进 行融合，形成的 杂 交瘤 细 胞既可产 生抗体，又可无性繁殖，从而 创 立了 单 克隆抗体 杂 交瘤技 术 。发展历史一般的 单 克隆抗体制 备 方法大同小异。都包括 动 物免疫、细 胞融合、 选择杂 交瘤、 检测 抗体、 杂 交
2、瘤 细 胞的克隆化、 冻 存以及 单 克隆抗体的大量生 产这 一系列 实验 步 骤 。常用方法1. 单 一特异性，与一个抗原决定簇反 应 ；2. 可重复性，能 够 提供完全一 样 的抗体制 剂 ；3. 一 经 制出，可无限量地供 应 ；4. 生 产单 克隆抗体，不一定需要 纯 的抗原；5. 能 查 出混合物中存在的用常 规 方法 查 不出的少量成分。优点 三、 实验 材料1 仪器设备2 手术器具超 净 工作台、恒温培养箱、超低温冰箱、倒置 显微 镜 、精密天平或 电 子天平、液氮罐、离心机、37 水浴箱、 纯 水装置、 滤 器、真空 泵 等。剪刀、 镊 子、解剖板 、 平皿（直径 为 10cm
3、），15ml/50ml一次性离心管， 50ml玻璃融合管 200目不 锈钢细 胞 筛 ，玻璃注射器 针 芯， 10ml玻璃注射器（ 9号 针头 ） 4 试验动物 ICR小鼠 1只， BALB/c小鼠 1只 3 实验试剂PEG1500， 无血无抗 RPMI1640培养基 ，HT/HAT培养基（含 10%FBS/CBS，工作 浓 度HT/HAT的 RPMI1640培养基） 5 Sp2/0细胞融合前一周复 苏 ，第二天 换 液， 长满 后 传 代，融合前一天 换 液。一次融合需 23瓶（ 75m2）Sp2/0细 胞。四、 实验 步 骤 (1)1. 取饲养细胞取一只 SPF级 6-8周龄 ICR小鼠，
4、断颈处死，置 75%乙醇中消毒 5min取一只 10ml玻璃注射器，吸入 78ml含 10%FBS、 HAT的 RPMI1640培养基，剪开皮肤、沿切口上下撕开皮肤，充分暴露腹部，换镊子，拎起腹膜，沿腹部中线偏左下方进针，针头不要进入内脏器官，取一个干净的酒精棉球轻轻挤压小鼠腹部，同时反复吹打注射器，反复 3-5次，待培养基变黄后将其转移到 80mlHAT培养基中，备用。 2. 取免疫小鼠脾脏免疫小鼠摘眼球取血后断颈处死，置 75%乙醇中消毒 5min将高压过的细胞晒放到平皿中，细胞晒中加入 10ml左右的无血清 1640，小鼠左侧卧位，剪开皮肤，沿切口上下撕开皮肤，可以看到脾脏所在位置；换剪
5、刀、镊子，剪开腹膜，充分暴露脾脏；换剪刀、镊子，镊子轻轻夹住脾脏，用剪刀分离脾脏，尽量不要带结缔组织，将脾脏放入钢网中，用无菌的针头戳几下，用玻璃针芯轻轻挤压脾脏直至仅剩包膜，用几毫升无血清 1640冲洗针芯和细胞晒，将滤液置于 50ml离心管中，备用。3. 收集 Sp2/0细胞 取已长满的 Sp2/0细胞 23瓶，用弯头尖吸管将细胞吹下来，置于 50ml离心管中，原瓶补液继续培养4. 清洗脾细胞和 Sp2/0 细胞 800rpm，离心 5min弃上清，轻轻磕几下 50ml离心管底部（使细胞团块松散），加入两吸管无血清 1640，轻轻吹打均匀，补培养液至 20ml脾细胞和 Sp2/0 细胞，
6、800rpm，离心 5min5. 融合 将 PEG1500置于 37 水浴锅上，熔化后，加入 0.5ml无血清 1640，混匀，即为50%PEG取离心好的脾细胞和 Sp2/0细胞，弃上清（注意保持这个姿势）用滤纸条轻轻沾去管壁上的培养液（保证 PEG不被稀释）。将离心管放到 37 水浴中（用一小烧杯制备水浴）， 1min加入 PEG（边加边搅），搅 30sec；静止 1min。四、 实验 步 骤 (2)四、 实验 步 骤 (3)6. 终止 将一吸管无血清培养液在 1min内加入细胞中，动作尽量轻柔，边加边搅。（此时，细胞在 PEG作用下已变形皱缩，加液太快，动作过粗，会引起细胞破裂死亡。）随后
7、，不用计时，但仍要慢慢滴加培养液，最后补液至 20ml。800rpm，离心 5min7. 铺板 弃上清，细胞团块溶于 100ml HAT培养液（前面已经准备好的）内，充分混匀后，铺板 5-7块。置于 37 ， 5%CO2培养箱 ,第二天检查是否污染，第五天计算融合率，第七天换液（一定要沿孔壁把原孔液体吸干净），第十天检测 。五 . 注意事 项1 .无菌操作：单克隆抗体的制备过程需要 严格无菌 ，包括使用的器械 、试剂等均需要无菌处理， 注意实验操作中的无菌操作 ;2. 用于免疫的动物，应选择与亲本骨髓瘤细胞同一品系的动物 ;3. 抗原免疫用的抗原尽量设法提高其纯度，并保存其活性 ;4. 融合剂 PEG对细胞有毒性，一般采用分析纯规格；浓度越高，对细胞 的毒性越大。谢谢你的阅读v知识就是财富v丰富你的人生
