1、 1 天然产物 抗辐射功能 的 评价 方法 江雪 徐灵 冯唐锴 （ 景德镇学院 ，江西 景德镇 333000） 摘 要： 随着经济的发展和物质生活的不断改善，食品的安全、环保、保健功能等越来越被人们所重视。寻找并研究具有保健功能的天然产物已经成为目前食品研究领域一项热门项目。本文 回顾了近年来 针对具有辐射防护功能的 天然产物 的研究 中 所采用的各种论证指标， 发现 目前主要从生存实验、造血系统、遗传物质、氧化应激水平以及免疫系统等多方面的指标来衡量天然产物的抗辐射功能。通过对各指标进行 总结归纳 ，提出未来天然产物抗辐射研究方法的可 能趋势，为今后 具有辐射防护功能的保健食品、 功能性 食
2、品添加剂的研发 提供参考。 关键词： 天然产物；抗辐射；评价方法 Evaluation Methods for Radioprotector in Natural Products JIANG Xue XU Ling FENG Tang-Kai (JingDeZhen University, JingDeZhen 333000， JiangXi , China) Abstract: With the development of economy and the improvement of material life, people has special concern on the saf
3、ety and the health care function of food. To find and research the health care function of natural products has became a popular research field at present. We reviewed the past researches of evaluation methods for non-toxic radiation protector in natural products, and found that the radioprotection
4、was estimated by the detection of targets related to survival rate、 hemopoietic system、 genetic material、 oxidation-reduction system、 immune system and so on. To review various indexes, and puts forward the future of methods for radioprotector in natural product may trend, to provide the reference f
5、or the future with radiation protection function of health food and food additives. Key words: natural product; radioprotector; evaluation method 现如今世界范围内的放射性污染程度在不断扩大， 辐射可以说已经和人们生活融为一体，现代生活已经离不开各种家用电器尤其是手机，更不用说 放射疗法在肿瘤治疗中的广泛应用，辐射在矿产等资源探测中的使用等， 都给生物界带来了潜在的、慢性的副作用或急性伤害 1。有研究表明，作为当今国内外第一致盲眼病的白内障，其致病诱因
6、中占第五位的就是微波辐射 2。 辐射对生物体的影响是复杂的，长期过量的辐射将导致机体产生一系列损伤，包括造血系统的功能异常、 氧化应激损伤、 免疫功能障碍及细胞 DNA 链断裂、基因突变、细胞转化 以及 死亡等 1。 既然人们已经无法离开辐射，那么如何防患于未然，如何减少辐射给人类带来的损伤则引起了普遍关注。 自古东方亚洲国家就有药食同源的传统，非常注重保健 食品 、功能食品的开发，而功能性食品添加剂，特别是一些天然提取物的明显功效，也早已在国际上得到认可。如茶多酚、番茄红素、大豆异黄酮等， 以其卓越的生理活性以及 明确的防病抗病功能，原料又来自食物或者天然物， 而受到广大消费者的欢迎。 天然
7、、营养、多功能 是如今国际社会的消费潮流。所以 如何 从 无毒副作用的天然产物 中筛选能够 防止辐射引起的病变 的种类 也 早 已成为热门课题。 本文就近年来在天然产物中筛选和验证辐射防护 功能 的研究 报道， 对研究中所采用的 评价 方法、指标进行了总结归纳 ，为今后抗辐射功能性食品的研发提供参考 。 辐射防护功能的检验评价分体内实验模型（又称整体实验动物模型）和体外实验模型。综合众多天然产物抗辐射功能的研究文献发现，对天然产物抗辐射功能的动物 体内实验研究主要都是通过 以 下几方面的指标进行论证： 1、生存实验； 2、体重 3、造血系统指标； 4、遗传物质指标； 5、氧化应激水平指标； 6
8、、免疫系统指标。而目前在体外研究中则主要从辐射敏感细胞 增殖活性 、凋亡率以及遗传物质损伤情况等方面进行探讨。 补充作者简介（作者简介：姓名（出生年 ），性别（民族），职称，学历，研究方向： 。） 2 1、 体内 实验 模型 1.1 生存 实验 早在上个世纪五十年代开始，小鼠 30d 存活率就已作为标准的抗辐射药物筛选方法之一 3。 樊黎生 4研究了黑木耳多糖的抗辐射效应，发现以 0.3-0.8g/kg 剂量的黑木耳多糖对小鼠进行灌胃，与对照组相比能够显著提高小鼠的 30 天存活率。 王清吉 等 5对 茶多酚以及银杏内酯的辐射防护作用的研究表明，与辐射模型组相比，茶多酚以及银杏内酯给药组的平均
9、存活率有显著增高，分别是 66.6%和 75%。 生存率反映了辐射损伤对 生命在整体上的 危害程度，能够有效提高生存率则提示样品能够对辐射起到防护作用。 1.2 体重 邓海平 6通过使用不同剂量的 X 射线对小鼠进行辐照后，发现 大 剂量辐射会 导致辐射组体重明显低于 未经辐 照组 ， 这可能与辐射对机体胃肠道结构功能破坏，影响 营养的吸收，以及对其他各组织器官损伤的综合影响有 关 ，进而造成 动物体重增长缓慢甚至停滞 。所以动物的体重变化可以 在 一定程度上反映出机体的损伤、修复状况 ，但单独一个体重指标并不 足以 说明 ，必需结合其他指标进行综合评价 。 1.3 造血系统指标 （ 1） 血
10、液学指标 胡筱波 等 7在照射后不同时相点 (1、 3、 5、 7、 9、 12、 16、 20 天 )对小鼠尾静脉取血，利用血细胞自动分析仪分析照射后小鼠外周血像变化，包括白细胞、红细胞、血小板 数 以及 血红蛋白量 。发现机体受照射后，外周血细胞几乎都 会 经历这样一个过程：初期迅速下降，恢复期则逐步 上升恢复 。 油菜花 酶解肽 组 与辐射对照组相比，给药组的血细胞下降幅度小而且恢复更快。所以认为 油菜花粉 酶解肽 对辐射引起的造血损伤有明显的防 护作用。 辐射对血液和骨髓造血系统的影响是放射生物学研究的一个十分重要的领域。造血系统损伤程度直接关系到辐射剂量的估算及辐射损伤的估算、治疗和
11、预后。造血干细胞是产生各种血细胞的最原始的细胞，是维持机体正常造血、保障造血系统损伤后重建的关键细胞 8。当全身或大部分机体受到较大剂量射线照射后，造血组织的损伤是机体最早出现的基本损伤之一。射线对造血系统的损伤主要表现为造血功能的破坏和抑制。而造血功能障碍主要表现为全血细胞减少，由此诱发机体感染、出血、免疫功能抑制甚至死亡。 由于外周血中血细胞数量可反映骨髓的造血功 能 ,因此 ,检测辐射后小鼠外周血中血细胞数量的变化可以用于评价辐射防护剂的防治作用 7。 （ 2） 内源性 脾结节 （ CFU-S） 计数 脾脏作为小鼠的造血组织终身具有造血功能，参与了调节骨髓造血。 脾结节（ CFU-S）是
12、 机体受到照射损伤时，造血细胞因凋亡坏死而数量急剧减少，部分残存的、小量具有增殖分裂能力的造血干细胞从骨髓迁移到脾脏 增殖、分化，最后生成一定数量和大小不等的脾集落 9。 CFU-S 测试是最早、最经典的造血干细胞的测试手段 10。 脾结节数量的多少反映了造血干细胞的功能及相对数量，与骨髓中具有增殖分裂能力的 造血干细胞数量呈现良好的线性关系 11。江雪 12在研究紫甘薯多糖的抗辐射作用时发现，随着紫甘薯多糖高、中、低剂量的增加， 实验小鼠 脾结节数有所增加，并且和辐射模型组相比，增加量均有显著差异，存在一定的剂量依赖性。结果显示，紫甘薯多糖能够增加受照小鼠 CFU-S 的数量，提示紫甘薯多糖
13、对辐射小鼠的保护作用一方面可能是通过促进骨髓造血干细胞的分化、增殖而实现的。 脾结节计数可间接反映 骨髓辐射损伤的重建恢复能力， 所以是观察抗辐射药物的可靠方法 13。 （ 3） 骨髓细胞 DNA 含量或骨髓有核细胞数 骨髓细胞 DNA 含量或骨髓有 核细胞数的下降是辐射损伤的表现之一，在一定范围内，照射剂量与骨髓细胞 DNA 含量或骨髓有核细胞数成反比，恢复时间与之正比，故而对骨髓细胞 DNA 含量或骨髓有核细胞数的检测可以代表造血系统受损伤以及恢复情况 14。 马征 15研究 白藜芦醇 对辐射小鼠的辐射损伤作用时发现，经过辐照后模型小鼠骨髓有核细胞数迅速下降， 中、高剂量 给药组小鼠的骨髓
14、有核细胞数随较未受辐射小鼠有所降低，但远高于模型组 ，差异有统计学意义，可见白藜芦醇对辐射所致骨髓有核细胞的下降有抑制作用，反映样品对造血系统有辐射防护作用。 （ 4） 骨髓造血组织面积 3 该 指标指的是骨髓造血组织面积占造血组织和脂肪组织面积之和的比例。骨髓造血组织面积反映的是造血细胞的增生程度，通过对骨髓组织切片观察骨髓组织结构变化，是反映骨髓造血功能重建与否的指标之一 16。 黄茜 17在研究八珍汤对骨髓的保护作用时，发现 经过放化疗复合造模，小鼠骨髓造血系统受到严重破坏，有效造血面积大量减少，脂肪细胞大量增多，而八珍汤 各剂量给药组均能改善小鼠骨髓造血面积减少的状况 ，再联合外周血像
15、指标、有核细胞数等指标的检测提示八珍汤能有效促进骨髓损伤小鼠造血功能重建 。 （ 5） 细胞凋亡率 Richardson18的 研究表明，电离辐射 会 加速细胞衰老，引起细胞周期阻滞 ， 并 诱导细胞凋亡。 孙元琳等 19用 60Co 射线对小鼠进行小剂量亚慢性照射 后 ， 实验结果表明 ， 正常对照组的骨髓细胞表达为阴性 ,只有少数细胞发生凋亡，辐射对照组的骨髓细胞发生了明显的凋亡，阳性细胞数量增多，颜色较深。当归多糖灌胃组的阳性细胞数量也有所增加 ,但均低于辐射对照组，且颜色较浅。另外孙元琳 19还对小鼠的肝细胞的 凋亡相关基因 bcl-2 蛋白的表达进行了检测，发现当归多糖对由于辐射损伤
16、导致的 bcl-2 异常表达而产生的肝细胞凋亡具有抑制作用，从而促进 了肝细胞的修复和增殖。 肝脏作为人体最大的器官，对电离辐射也十分敏感，它是机体早期主要的造血器官，并且肝脏的解毒功能与血液循环有着密切的关系，能够抑制肝细胞的辐射损伤能够说明被试样品对造血组织的保护功能。 所以 ， 对 骨髓干细胞、肝细胞的 凋亡率 的研究可以进一步验证样品对细胞的分裂增殖 是否有促进保护作用， 能够 评价造血系统 恢复与否的有效指标 20。 1.4 遗传物质受损情况检测 （ 1） 骨髓 嗜多染红 细胞微核率 实验 电离辐射作用于机体，从照射开始直至出现生物学效应 (细胞死亡或癌变 )是一个极其复杂的过程，D
17、NA 的辐射损伤是其中最关 键最重要的一环，而 DNA 的双链断裂又是辐射引起的各种生物效应中最重要的原初损伤 21。 大量实验证明，电离辐射可导致细胞 DNA 双链断裂，高剂量辐射能抑制 DNA 合成、增加细胞膜通透性甚至直接杀死细胞 22。 有报道 23称放疗后微核率的变化与急性放射损伤呈正相关 。 因此微核的检出率能准确地反映出染色体受损的情况即辐射损伤的程度和机体的修复能力，可作为诊断辐射损伤的重要生物学指标和诊断依据，并已普遍应用于辐射损伤诊断及辐射防护药的筛选。 紫甘薯多糖抗辐射功能的研究结果显示 13， 与正常对照组比较，辐射模型组的小 鼠骨髓细胞的微核率显著升高，说明辐射损伤模
18、型成功，而高、中剂量组小鼠的微核率虽然 仍 高于对照组，但与模型组有显著差异，说明紫甘薯多糖对 遗传物质的 辐射损伤 具有 一定的保护作用。 微核 实验 用于检测染色体损伤具有简便、准确、快速的特点，若在实验室以小鼠等啮齿类动物为 实验 材料的检测，则更多推荐检测骨髓细胞微核率。而人外周淋巴细胞微核 实验 ，已作为放射工作人员在岗期间健康体检的必检项目之一 24。 （ 2）单细胞凝胶电泳实验（又称彗星实验 ） 单细胞凝胶电泳实验又称彗星 实验 ，能够在细胞水平上检测 DNA 损伤，其原理是碱性电泳液中 ，DNA 双链解螺旋变性为单链，单链断裂的碎片可进入凝胶中，在电场的作用下向阳性迁移，形成拖
19、尾，呈彗星样图像，细胞拖尾表示细胞有 DNA 断裂碎片生成， 曹毅 25的研究显示损伤 拖尾越长表示 DNA 断裂越严重 。 因此彗星实验可以进一步验证样品对遗传物质是否有保护作用。 黄翔等 26对每只小鼠随机选择 50 个细胞，用 CASP 彗星图像分析软件对彗星细胞尾部 DNA百分率（ Tail DNA%）和尾矩（ Tail Moment 为彗尾 DNA 百分率和彗尾长度的乘积），实验结果表明黄花倒水莲各剂量组的 Tail DNA% 和 Tail Moment 与辐射模型组相比均显著降低 ，且存在剂量依赖，证明黄花倒水莲对 DNA 具有辐射保护作用。 1.5 氧化应激水平指标 （ 1） 血
20、 组织中 过氧化脂质含量 自由基是辐射能量吸收和生物分子损伤的重要媒介，辐射引起的细胞毒性作用几乎全部受到氧自由基的调节 27。受到辐射损伤的机体中氧自由基 ROS 和氮自由基 RNS 浓度会大幅增高，从而引发脂质过氧化作用而产生的丙二醛以及褐脂质 ，此二者 具有很强的细胞毒性 28。因而测试过氧化脂质含量常常可反映机体内脂质过氧化的程度，能够间接的反映出细胞损伤、修复的程度。 4 （ 2） 血 组织中抗氧化酶活性 在正常机体内，有一套有效的抗氧化防御系统，来防止活性氧 (ROS)对机体的损伤，如超氧化物歧化酶 (SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-px)和过氧化氢酶 (CAT)， SOD
21、 具有减少超氧阴离子 (O2-)的作用， GSH-px 和 CAT 则能降低过氧化氢 (H2O2)含量。氧化和抗氧化的平衡是决定细胞生存的条件，及时清除体内过剩的自由基，才能维持自由基的动态平衡。不断清除多余活性氧自由基是保护机体组织的一种重要机制 27。 江雪 12检测了辐射小鼠的血清、肝 和 肾当中的 抗氧化酶活性 以及丙二醛的含量 ，实验结果显示，辐射模型组的 SOD、 GSH-px 和 CAT 的活性相较空白组显著降低， 丙二醛含量明显增高， 说明造模成功，紫甘薯多糖灌胃组相较于模型组抗氧化酶有明显的升高， 丙二醛含量也显著降低， 说明 紫甘薯多糖 抗辐射机理与 提高辐射小鼠的抗氧化能
22、力，减少自由基的产生 ，抑制过氧化脂质的产生有关 。 所以 血 组织中 过氧化脂质的含量以及抗氧化酶 的活性变化可以代表机体 氧化还原系统受损、修复状况 。 1.6 免疫系统检测指标 （ 1） 脏器指数 免疫系统属于辐射敏感组织，辐射所致的免疫功能改变是辐射损伤的主要表现之一。胸腺和脾脏是机体参与免疫功能调节的重要的免疫器官 ，是对辐射高敏感的细胞群。 有研究表明 12,17受辐射处理的模型组与空白组相比小鼠脾脏系数、胸腺系数显著降低，机体免疫功能降低，紫甘薯多糖给药组能显著提高小鼠脾脏、胸腺指数，而八珍汤低剂量组的小鼠脾脏指数与正常水平基本持平，可见被试样品能够保护免疫器官抵抗辐射损伤。 所
23、以免疫脏器指数 如胸腺指数和脾脏指数 在一定程度上能够反映免疫系统的损伤、修复状况 29。 （ 2） 单核 -巨噬细胞活性 功能测定 机体能够维持正常的免疫功能状 态，有赖于各种免疫细胞在免疫应答和免疫调节过程中相互协作、相互制约，以产生适度的免疫应答，共同完成对抗原性物质的识别、应答和清除，来维持机体内环境的稳定，却又不致损伤机体自身组织 30。免疫应答分固有免疫即非特异性免疫应答和适应免疫（体液免疫和细胞免疫） ， 单核 -巨噬细胞 属于免疫系统中的固有免疫 。 吴显劲 31的研究认为琼枝麒麟菜多糖能够显著增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的作用，并且诱导巨噬细胞产生 L-1等细胞因子 ,从而
24、发挥对辐射损伤小鼠腹腔巨噬细胞的保护作用。另外， 小鼠碳廓清实验 和 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡 红细胞实验 是两个能够反映 单核 -巨噬细胞 系统 的吞噬能力 的实验 ，二者 结果均为阳性或者 任一 实验两个剂量组以上 结果为阳性 即 可判定单核 -巨噬细胞功能结果阳性 15。 （ 3） NK 细胞 (自然杀伤细胞 natural killer cell )活性 功能测定 王亚飞 等 32以 粗江蓠多糖 灌胃小鼠检测辐射后体内 NK细胞的活性，结果显示模型组小鼠 NK细胞活性明显低于正常组，而给药组能够显著提高 NK细胞杀伤靶细胞的能力，说明粗江蓠多糖能够增强辐射小鼠 NK细胞活性。 NK细胞在
25、机体内发挥着非特异性抗感染效应， 卫生部的 保健食品检验与评价技术规 范中提示 15通过测定单核 -巨噬细胞活性 和 NK细胞活性可以 反映出机体非特异性免疫应答的水平。 （ 4） 细胞免疫 功能测定 朱咏梅 33发现海生多糖高、低剂量均能够显著提高辐射导致的脾淋巴细胞转化率，虽未使之恢复到正常水平，但与辐射模型组相比有显著差异。 在对保健食品的免疫功能评价规范中有提示 15， 通过迟发性变态反应 实验（ DTH） 以及小鼠脾淋巴细胞转化两个实验，可以反映出机体细胞免疫水平的变化。两个实验 结果均为阳性或者任一实验两个剂量组以上结果为阳性即可判定细胞免疫功能测定结果为阳性。 （ 5） 体液免疫
26、 功能测定 马征 15对白藜芦醇的研究结果表明，辐射模型组与正常对照组相比，小鼠的血清溶血素显著降低，但给药组与辐射模型组比较，差异无统计学意义。说明辐射会使小鼠的血清溶血素降低，但是白藜芦醇对血清溶血素的降低无抑制作用。 血清溶血素和抗体生成细胞是反映机体体液免疫的重要指标， 两个实验 结果均为阳性或者任一实验两个剂量组以上结果为阳性即可判定体液免疫功能测定结果为阳性 15。 5 通过脏器指数、 单核巨噬细胞活性、 NK细胞活性测定、 细胞免疫功能测定 以及 体液免疫功能测定、几个 方面 相结合评价药物的免疫药理活性属于目前公认的可靠方法 34，能够对研究所筛选出的天然产物的抗辐射机理有一定
27、参考指导价值。 2、 体外 实验 模型 2.1 细胞 生长检测 体外细胞生长检测是用于反映 细胞增殖与死亡情况的指标，能够在众多天然产物中比较快速、准确的对具有辐射防护功能的样品进行筛选。 马天翔等 35 对红景天中 苷及其醇类化合物抗辐射有效活性成分体外筛选研究中，通过 MTS 法检测比较人淋巴母细胞受辐射后的存活率，得出各样品抗辐射活性依次为络塞维异槲皮苷红景天苷熊果苷酪醇洛塞琳的结果。 免疫细胞对辐射损伤极为敏感，因此免疫细胞亚群和功能检测对辐射损伤的评价及预后评估具 有重要的意义。 而 淋巴细胞是构成胸腺、脾脏、血液、骨髓等免疫器官的重要组成部分，具有较高的辐射敏感性 1，其损伤是辐射
28、导致机体免疫功能抑制的重要原因， 所以选择淋巴细胞进行体外细胞生长检测对研究 机体辐射损伤有重要意义。 2.2 细胞凋亡检测 细胞凋亡是由生理或病理性因素引起的一种细胞程序性死亡，电离辐射会诱导细胞产生病理性凋亡18。通过体外细胞 实验 检测细胞凋亡率可以一定程度 上 验证被试样品是否有辐射防护功能。 郭娟等 36对人胚肝细胞 L-02 进行辐射损伤造模，体外研究丹参素对其辐射损伤的保护作用，进行了细胞凋亡率检测，结果显示，丹参素预处理可以显著降低辐射诱导的 L-02 细胞凋亡率，与空白对照组最少相差 2 个百分点，而与辐射模型组至少相差 11 个百分点，差异有统计学意义。 2.3 细胞微核率
29、检测 、 彗星实验 郭娟等 36对 丹参素 体外研究中 同时还进行了细胞 微核 率和彗星尾的 检测，发现丹参素在一定浓度下能够抑制辐射所致细胞 DNA 断裂， 显著减少细胞 染色体 损伤。 说明被试样品对 L-02 细胞的遗传物质具有防护作用，即具有一定的抗辐射作用。 结束语 如何经济、准确、快速评价无毒副的天然产物抗辐射功能，以期能够为抗辐射保健食品及功能性食品添加剂 的研发提供 大量 原料库， 具有重要的 现实意义。 在目前 评价天然产物的抗辐射功能的众多 方法中， 体内实验和体外实验的关系是互相补充、互相验证的，通过体外的分子、细胞水平实验结合整体动物模型，能够比较全面地为评价天然产物的
30、抗辐射功能提供充分的实验资料。 体外 实验 影响因素小、可控性好， 具有一定优势， 但 因其 未必能够完全模拟体内环境，还需 在 体内 研究加以 印证；而辐射防护功能 的体内筛选也存在着时间、经济成本较高，所需化合物用量较大等问题和局限 。 如何 借鉴高通量药物筛选， 完善 利用辐射敏感细胞构建 的 体外辐射损伤模型 ，以 探讨天然产物在辐射 防护领域的开发应用价值 ， 应该 会成为 未来辐射防护剂 在天然产物中 的 筛选 评价 的趋势。 参考文献 1夏寿萱 .放射生物学 M.北京 :军事医学科学出版社 , 1998(6): 2-3 2叶娟 ,姚克 ,吴仁毅 ,等 .低强度微波辐射致兔晶状体上
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