1、1. Western Blotting方法方法n 直接法：直接法：优点：优点：1.快速（一种抗体）快速（一种抗体） 2.没有二抗交叉反应引起的非没有二抗交叉反应引起的非特异性条带特异性条带缺点：缺点：1.免疫反应性降低免疫反应性降低2.无信号二级放大无信号二级放大3.抗体标记费时昂贵抗体标记费时昂贵 ,使用不方便使用不方便Western Blotting方法 间接法：优点：1.免疫特异性不受标记影响2.信号放大 ,灵敏度高（多个二抗结合位点）3.多种标记的二抗可供选择 4.可选择不同的 Marker缺点：1.有交叉反应引起的非特异性条带2.额外的二抗孵育以及条件优化YYHRP HRPHRPSu
2、perSignal 底物与二抗底物与二抗 HRP,AP反应反应 ,显色或发光显色或发光5SuperSignalHRP,AP标记二抗与一抗蛋标记二抗与一抗蛋白复合物结合白复合物结合42漂洗和封闭漂洗和封闭1电泳分离，转膜，固定蛋白于膜上电泳分离，转膜，固定蛋白于膜上3一抗与蛋白结合一抗与蛋白结合 (小鼠单抗小鼠单抗 或兔多抗或兔多抗 )间接间接 Western Blotting操作流程操作流程 : HRP（辣根过氧化酶)AP（碱性磷酸酶）大小 40Kd 140Kd最佳酶活性 PH： 5 7 PH： 8 10酶活和二抗特异性 好于 AP抑制剂 氰化物，硫化物叠氮钠氰化物，砷酸盐，有机磷，二价阳离子
3、螯合剂稳定性 零度以下稳定 零度以下不稳定底物 很多 部分动力学特性 快速 慢价格 便宜 昂贵2. 两种检测酶系统的比较两种检测酶系统的比较3. 检测方法 化学发光法 : 灵敏、快速、高效、无害、特异性高 化学显色法 : 方便、有毒、灵敏度较低、不易保存 同位素法 : 灵敏度高、不安全、 环境污染、不方便和半衰期短 荧光底物法4. 影响影响 Western blotting成功的要素成功的要素n 蛋白抽提蛋白抽提 /样品制备样品制备 /电泳电泳n 膜的选择和转膜n 封闭液的选择和封闭条件的优化n 一抗和二抗的选择以及稀释倍数的优化 n “通用 ”二抗n 合适的底物：发光或显色底物n 曝光时间的
4、掌控n X- 光片 ,信号增强剂n Striping 抗体剥离 buffern Eraser it底片背景去除剂蛋白抽提 /样品制备 /电泳 蛋白抽提1. M-PER培养细胞总蛋白提取试剂Pro#78501, 78503, 785052. T-PER动物组织总蛋白提取试剂 Pro#：785103. B-PER细菌总蛋白提取试剂 Pro#：78243, 78248， 78260， 782664. Y-PER酵母总蛋白提取试剂 Pro#:78990， 78991， 78998 和 789995. I-PER昆虫细胞总蛋白提取试剂Pro#:898026. P-PER植物细胞总蛋白提取试剂Pro#:8
5、98037. Mem-PER真核膜蛋白提取 Kit Pro#:898268. NE-PER胞质 & 核蛋白抽提试剂Pro#788339. 线粒体抽提 Kit Pro#： 89874l 蛋白酶抑制剂 样品中是否有干扰物质 各种预制胶，转膜液， Markers膜的选择和转膜膜的选择和转膜膜： NC， PVDF转膜成功？QentixTM信号增强剂MiserTM抗体节约缓冲液（1/3 100)胶上 Western blotting转印膜比较转印膜比较PIERCE： NC， PVDF封封 闭闭封闭液的选择1. 无生物素，无血清蛋白2. 无交叉反应3. 1 15分钟封闭时间4. 10 20： 1的信噪比封闭条件的优化1. 时间2. 温度3. 去污剂
