1、毕 业 论 文题 目： 不同温度对猪精液保存效果的影响专 业： 动物医学目 录摘要 .1关键词 .11 材料 .31.1 试验动物 .31.2 试验仪器 .31.3 试验药品试剂 .32 试验方法 .42.1 精液稀释前的准备 .42.2 精液品质的鉴定 .42.3 精液的稀释与保存 .42.3.1 稀释液的准备 .52.3.2 稀释头份和稀释液用量的确定 .52.3.3 精液的稀释 .52.3.4 精液的分装 .52.3.5 精液的保存 .52.3.6 精液活力的计算与检测 .53 结果与分析 .63.1 精液品质鉴定结果 .63.2 稀释头份与稀释液用量计算结果 .63.3 不同温度下精液
2、的保存效果 .64 讨论 .84.1 如何取得新鲜精液 .84.2 稀释粉的选取及稀释的意义 .94.3 精液稀释的注意事项 .94.4 温度对精液保存的影响 .9参考文献 .11致谢 .131不同温度对猪精液保存效果的影响【摘 要】 为了检测长效比利时稀释粉 CXM-MY 在不同温度下对猪精液保存效果的影响，将用该稀释液稀释后的精液分别放置于 13、15、17、19、21条件下保存，每天定时对精子进行活力检测，以精子的活力为指标来判断保存效果。试验结果表明，用长效比利时稀释粉 CXM-MY 配制的稀释液在 17对猪精液保存的效果最好，在长达五天的保存之后，精子的活力还高达 44。【关键词】
3、精液 稀释液 保存效果Effects of different temperatures on the preservation of boar semenAbstract：In order to test the long-lasting Belgium CXM-MY dilute powder at different temperatures influence on boar semen preservation, will each be diluted with the dilution of semen after placed in 13, 15, 17, 19, 21 c u
4、nder conditions save day scheduled on sperm viability test, is based on sperm vitality indicators to judge the effect. Test results show that, with long-lasting Belgium dilutions of dilute powder preparation CXM-MY to 17 degrees Centigrade on boar semen preservation works best, for up to five days a
5、fter it has been saved, sperm vitality but also as high as 44%.Key words：Semen ;Dilution ;Effect off preservation 随着猪人工授精技术的逐渐普及并且经过逐步的完善，猪人工授精早已运用到生产实际当中，特别是在现代化程度较高的规模化养殖当中。猪人工授精有利于预防传染病，提高了公猪的利用率，可以适时给发情母猪输精配种，可以克服公母猪难以交配的困难，同时最大限度的从公猪这一块降低生产成本。猪人工授精技术之所以能够得到广泛的应用和推广必然离不开精液保存技术的研究和发展。常温保存是指将精液稀释后
6、保存在温度恒定的恒温箱内，目前普遍被接受的常2温保存温度是 1618。低温保存是指在常温下再进一步的降低温度使之接近冰点，但不至于使精液结冰。超低温保存是将精液温度降到冰点以下使精液冻结后保存，这是目前最先进的保存方法 1。常温保存相对于低温保存和超低温保存操作难度更低对设备要求也更为简单，在猪场实验室容易达到，缺点是保存时间略短，一般只能保存 6 天左右。在低温、超低温环境下精子的保存时间很长。其主要原理是在超低温下，精子的代谢几乎完全停止，在恢复常温时又可以恢复活性，期间精子几乎不运动不消耗营养物质。但是低温和超低温保存对设备的要求及其操作工艺更高，需要创造低温环境，相对于常温保存来说成本
7、更高，而且精子在冷冻和解冻过程中容易收到损伤，精子活力会比以前明显降低，从而导致受胎率低。所以，在规模化养殖当中，大多数都采用常温保存。研究表明，较低的温度下能够减少精子的能量消耗和有害代谢物质的生成 2。较高温度能最大限度的保持精子的活力但是伴随着稀释液中营养物质的急剧消耗以及微生物等有害物质的急剧增生，从而导致 pH 值升高，不利于精子生存。至今已有许多研究人员对猪精液常温保存温度持有不同的观点，董载勇等的配方筛选试验也显示了在1618恒温保存时，精子的存活时间更长和精子活力更高 3。笔者所在实习的猪场，常温保存精液的温度也是在 1618范围之内。但是经过笔者多方查询资料发现，不同配方的稀
8、释液在不同温度下对公猪精液保存的效果有所不同。本试验通过采取猪场最健康的长白公猪（耳号为 L132106）的新鲜精液用该稀释粉配制的稀释液进行稀释，将稀释后的精液分别放置于 13、15、17、19、21的恒温冰箱内保存，通过每天固定时间检测精子的活力值来探究其对精液的保存效果。31 材料1.1 试验动物精液采集自耳号为 L132106 的长白公猪，由三台新希望农牧科技有限公司清泉养猪场提供，并在该养猪场实验室完成实验。1.2 试验仪器电子天平（型号：LBD-30001 生产厂家：福州华志科学仪器有限公司） 、电子恒温水浴锅（型号：DZKW-4 生产厂家：北京中兴伟业仪器有限公司） 、100-1
9、000l 移液器、采精杯、恒温箱、1000ml 烧杯、温度计、玻璃棒、输精瓶、电子显微镜、载玻片、盖玻片、一次性食品袋、滤纸、pH 试纸、一次性消毒手套、洁净的纸巾、毛巾、标签纸。 （由三台新希望农牧科技有限公司清泉养猪场实验室提供）1.3 试验药品试剂长效比利时稀释粉 CXM-MY、双蒸水、1聚维酮碘溶液、伊红、3NaCl 溶液。42 试验方法2.1 精液稀释前的准备按照科学、正规的操作方法取得该公猪新鲜的精液 160ml。将盛有新鲜精液的采精杯放置于 37的水浴恒温锅里面暂时保存，先进行新鲜精液的品质鉴定，品质鉴定合格后方可进行精液的稀释。在精液稀释前，稀释液应该在 37的水浴恒温锅中预热
10、使温度和新鲜精液保持一致，然后再进行稀释操作。2.2 精液品质的鉴定精液的外观评定：通过肉眼观察精液的颜色。精液的气味评定：通过嗅觉直接闻头公猪精液的味道。精液的 pH 测定：用 pH 试纸进行 pH 值的测定。精子的活力检查：将载玻片和盖玻片都放入 37恒温箱预热，预热之后用移液器滴适量精液在载玻片上，然后轻轻盖上盖玻片尽量避免对精子产生损伤，同时盖上盖玻片之后不能产生气泡，在 400 倍显微镜下观察精子的运动状况。精子的密度测定：用移液器吸取公猪的精液 100l，然后加入 3NaCl 溶液 900l混合均匀使之稀释 10 倍。在血细胞计数室上放一盖玻片，取 1 滴上述精液放入计数板的槽中，
11、靠虹吸将精液吸入计数室内，将计数板固定在显微镜下，先用 100 倍镜找到计数室，再用 400 倍找到计数室的第一个中方格。以精子的头部为准，按照数上不数下，数左不数右的原则进行计数格线上的精子 4。按照这个标准计算从左上角到右下角五个中方格中精子的总数。精子的畸形率检查：将精液涂片，用伊红染色，在 400 倍显微镜下观察，分别进行了三个视野的观察，取平均数作为畸形率。经过外观评定和品质检测，采取的新鲜精液质量较好，活力在 80以上，精液的质量较好 5，可以进行进一步的实验。2.3 精液的稀释与保存52.3.1 稀释液的准备按照长效比利时稀释粉的说明书，将 1 包约 50g 稀释粉倒入并溶解在
12、1000ml 双蒸水中，用玻璃棒轻轻搅拌使稀释粉全部溶解在双蒸水中，制取 1000ml 稀释液备用。稀释液配制好以后，将盛有稀释液的烧杯放在 37的电子水浴恒温锅中预热至和新鲜精液一致的温度。2.3.2 稀释头份和稀释液用量的确定在精液稀释前，需要进行稀释头份的确定。猪人工授精正常计量一般为 40 亿个精子/头份，体积为 100ml。因此精液的稀释公式为：精液稀释份数=精液体积精液密度/40；稀释液用量计算公式为：稀释液用量（ml） =（100精液稀释份数-精液体积） 。2.3.3 精液的稀释先用温度计分别测定稀释液和新鲜精液的温度，当稀释液温度和精液温度相近时开始进行精液的稀释操作。将盛有新
13、鲜精液的采精杯从水浴恒温锅中取出放于毛巾上，左手用一根玻璃棒一端靠近精液液面和采精杯杯壁临界处，右手持烧杯将烧杯口靠着玻璃棒将稀释液缓慢流入精液中。先加入 160ml 稀释液先进行 1：1 的低倍稀释 6，然后轻轻摇匀，等待一两分钟之后，使精子慢慢适应外界条件的变化，再把剩下需要的稀释液缓缓加入。最后将盛有精液的食品袋袋口捏紧，然后轻轻缓慢倒立采精杯几次，让精液和稀释液充分混合均匀。2.3.4 精液的分装装取 5 瓶稀释后的精液，分别贴上标签纸并标号 1、2、3、4、5，分装精液时尽可能的装满输精瓶，为了尽可能的排尽空气，可以稍稍用力挤压输精瓶使其稀释后的精液液面与瓶口平行，然后盖上输精瓶瓶盖
14、。2.3.5 精液的保存将标号为 1、2、3、4、5 的精液分别放入温度控制在 13、15、17、19、21的恒温冰箱内保存，保存时恒温冰箱内衬入毛巾，防止直接放入恒温冰箱对精子产生损伤。保存时每间隔 12 小时左右要将精液顺时针转动混匀，防止稀释粉因温度下降析出沉淀和精子太集中争夺营养成分，不利于精子生存。同时，稀释后的精液要防止剧烈震荡，阳光直射和其他异物进入 7。2.3.6 精液活力的计算与检测每天在固定的时间对五瓶精液进行活力检测（活力的计算公式：精子活率=呈直线前进运动精子数/总精子数100%） 8，分别记录下不同温度下每次检测到的精子活力。63 结果与分析3.1 精液品质鉴定结果精
15、液颜色为乳白色，精液中没有血丝、颗粒状黄白点及其他杂质。公猪精液的味道微带腥味，没有氨气味、尿味及其恶臭味等其他不正常气味。精液的 pH 值为 7 左右，表明公猪精液 pH 均正常。直线前进运动的精子占 85左右，旋转和原地摆动的精子在 15左右。即精液活力为 0.85。从左上角到右下角五个中方格中精子的总数为 420 个。即精子密度4205101000102.1 亿/ml。精液的畸形率为 10。3.2 稀释头份与稀释液用量计算结果采得的精液可以稀释的头份数为 1602.1/40=8.4 头份，需要的稀释液的量为（1008.4-160）ml=680ml。3.3 不同温度下精液的保存效果把每天试
16、验精液的活力检测数据进行统计和分析，活力用直线前进运动的精子所占的百分率表示。结果见表 1表 1 不同温度下精液的活力值天数 13 15 17 19 211 76% 80% 84% 82% 78%2 70% 77% 80% 76% 69%3 62% 67% 72% 67% 56%4 50% 53% 60% 57% 38%5 32% 34% 44% 37% 16%7从表 1 可以看出，精液在 17下保存，连续 5 天的检测精子活力都比其他四个温度下要高，在长达 5 天的保存之后精子活力都还能达到 44。这表明该稀释液在 17保存下，对精液的保存效果最好。再看 15和 19保存下每天精子活力的数据
17、，都要比 13和 21要好，表明温度越接近 17对精液的保存效果越好。对比 13和 21的数据可以发现仅仅是在第一天的时候精子活力略低于 21，在之后的四天精子活力都比 21要高。在第五天的时候，21条件下保存的精液精子活力降到了 16，比其他四个温度都要低很多，说明该稀释液在 21条件下对精液的保存效果最差。分析图 1 精液活力变化曲线，17曲线一直处于其他四条曲线之上，这说明 17保存下的精子活力一直都要比其他四个温度保存下的要高。17曲线下降幅度也是最缓慢，从第一天到第五天精子活力的下降率仅为 47.6。相反 21曲线几乎一直处于最下面，下降的幅度也最快，从第二天开始精子活力值便急剧下降，从第一天到第五天精子活力的下降率高达 79.5，说明经该稀释液保存的精子活力值下降十分迅速，该稀释液在21温度下不利于精液的保存。15和 19曲线下降幅度比 17略快，相比 13和21曲线又要缓慢很多，13、15、19保存下的精液精子活力从第一天到第五天下降率分别为 57.9、57.5和 54.8，这些数据说明温度越接近 17该稀释液对精液的保存效果越好。对比 13和 21曲线发现，高温对精液保存效果的影响更明显。为了取得良好的精液保存效果，降低生产中的成本，该猪场对精液的保存温度应该控制在 17左右。
