1、1西藏拮抗酵母对柑橘采后病害的防治效果及其作用机理初探Evaluation of Antagonistic Yeast from Tibet against Postharvest Decay of Citrus and its Mechanism摘要从西藏地区分离和筛选对柑橘主要采后病害绿霉病和青霉病具有良好生防治果的耐低温拮抗酵母。其中一株效果显著，经鉴定为罗伦隐球酵母（Cryptococcus laurentii） 。当该酵母细胞悬浮液浓度为 108 个/mL 时，在 4下分别能抑制柑橘绿霉病和青霉病发病率至 30%和 20%，而相同条件下对照的发病率为 100%。该酵母不同处理液的体内
2、试验和体外孢子萌发试验结果表明其主要作用机理仍为与病原菌的营养和空间的竞争作用。而其分泌的生防相关酶活性较高，是其低温生防效果良好的另一主要原因。该酵母胞内高含量的海藻糖和脯氨酸使其对低温的耐受性增强，从而在低温条件下能够更好地抑制水果病原菌的生长，达到防腐保鲜效果。同时本论文也证明了从高寒地区获得耐低温拮抗酵母的可能性。关键词:生物防治、采后、罗伦隐球酵母、西藏、柑橘AbstractCold-adapted yeasts were isolated from Tibet and evaluated as a potential biocontrol agents against green
3、mold(Penicillium digitatum )and blue mold (Penicillium italicum) of citrus fruit in cold storage. One strain of the yeasts, an isolate identified as Cryptococcus laurentii, was found to exhibit the greatest biocontrol activity among the different isolates that were screened. A concentration of 108 c
4、ells/mL of the strain reduced the incidence of decay of green mold and blue mold to 30% and 20% in cold storage, respectively, compared to the control where decay incidence was 100%. In vivo and in vitro experiments of the yeast indicated that its 2major mechanism is to compete for nutrients and spa
5、ce with pathogens. Higher enzyme activity also allowed the strain of yeast to perform better biocontrol activity in cold storage. Besides, higher intracellular level of trehalose and proline provided in the strain of yeast increased the tolerance of this strain to low temperatures and effectively pr
6、otect citrus from pathogens in cold storage, relative to the other strains that were evaluated. Apparently the present study demonstrated the ability to select cold-adapted yeasts from cold climates and use them as biocontrol agents of postharvest diseases of fruit placed in cold storage. Key words:
7、 Biocontrol, Postharvest, Cryptococcus laurentii, Tibet, Citrus3目 录摘要 .1Abstract.12 实验材料与方法 .62.1 主要仪器 .62.2 试剂 .62.3 受试果实 .72.4 病原菌 .72.5 拮抗酵母 .82.6 西藏拮抗酵母在柑橘果实体内复筛试验 .82.7 菌种鉴定 .92.8 西藏罗伦隐球酵母在不同温度条件下的防腐保鲜效果 .92.9 西藏罗伦隐球酵母不同处理液对柑橘的防腐保鲜效果 .102.10 西藏罗伦隐球酵母对病原菌孢子萌发的抑制效果 .112.11 拮抗酵母生防相关酶活测定 .112.11.1
8、酶的提取 .112.11.2 几丁质酶活性的测定 .112.11.3 -1,3-葡聚糖酶活性的测定 .122.12 拮抗酵母耐低温物质含量测定 .122.12.1 样品制备 .122.12.2 海藻糖含量的测定 .122.12.3 脯氨酸含量的测定 .122.13 数据处理与分析 .133 结果与分析 .133.1 西藏拮抗酵母在柑橘果实体内复筛试验 .133.2 菌种鉴定 .143.3 西藏罗伦隐球酵母在不同温度条件下的防腐保鲜效果 .143.4 西藏罗伦隐球酵母不同处理液对柑橘的防腐保鲜效果 .183.5 西藏罗伦隐球酵母对病原菌孢子萌发的抑制效果 .223.6 拮抗酵母生防相关酶活测定
9、.243.7 拮抗酵母耐低温物质含量测定 .2544 讨 论 .26参考文献 .27致 谢 .3051 前言我国是世界水果生产的第一大国，其中营养丰富、味道甜美的柑橘产量也位居世界首位。但每年因侵染性病害造成柑橘采后腐烂严重，经济损失巨大。柑橘贮运过程中，引起柑橘腐烂的常见侵染性病害主要有指状青霉(Penicillium digitatum Sacc)引起的绿霉病和意大利青霉(Penicillium italicum Wehmer)引起的青霉病 1-7。为了延长货架期，通常将柑橘储置于低温储藏（0-5） ，但仍发生大量青霉病和绿霉病病害。长期以来，高效、经济的化学杀菌剂是柑橘采后病害防治的主要
10、方法，如抑霉唑、特克多、邻苯酚钠、仲丁胺以及苯并咪唑类（如多菌灵、托布津）杀菌剂等 2, 4-7。但是，长期使用同一种杀菌剂会出现病原菌的抗药性问题从而使杀菌剂的防治效果大大降低，同时抗药性菌株对甲基托布津、苯来特、涕必灵等三种苯并咪唑类杀菌剂具有交叉抗性 8，另外农药残留、危害人类健康和环境污染等一系列问题也越来越得到消费者的重视 9。因此开发新型绿色环保的生物防腐保鲜剂成为当今水果采后保鲜的研究热点，其中具有拮抗作用的酵母菌作为生物防治剂，由于其具有拮抗效果好、不产生毒素、可以和化学杀菌剂共同使用等优点成为近 20 年来研究的主要对象，研究工作主要集中在筛选和应用能够抵抗由水果病原真菌引起
11、的果实采后病害 4, 10-12。然而，拮抗酵母所存在的缺点也限制了它的推广和应用，尤其是酵母菌在环境中的不稳定性和较短的货架期这两个问题最为突出 13。而引起这些问题的主要原因是由于酵母菌株在施用过程中会受到不同环境条件的影响，包括氧化胁迫、渗透胁迫、高温胁迫和低温胁迫等。而解决低温胁迫问题的方法之一便是筛选获得具有耐低温适应性的拮抗酵母，特别是从一些具有极端条件的地区获得，如南极洲、极地的水中，海洋和其他寒冷地区 14, 15。青藏高原，被誉为“世界第三极” ，远离海洋，低纬度，高海拔，疆域辽阔，地形复杂、高差变化极为悬殊，植被类型多样，区系成分复杂，其独特的地理环境、高原气候造就了极富特
12、色的自然资源，包括微生物资源。但是目前，国内对于利用西藏菌种资源进行生物防治研究的报道还不多，所研究的菌种基本都属于细菌和放线菌。Zhao, J.等 16研究了来自西藏的一株链霉菌对香瓜的生物防治作用。6本论文旨在现有的生物防治研究的基础上，以西藏微生物资源开发利用和柑橘生物防腐保鲜剂的开发为目的，系统研究从西藏地区分离在低温条件下对柑橘采后病害具有良好防治效果的拮抗酵母，探讨其在低温条件下对柑橘采后病害的生物防治效果及其作用机理，优化其生物防治的条件，建立以西藏拮抗酵母为生防菌的柑橘生物防腐保鲜方法以期替代化学方法来减少柑橘果实采后的经济损失，具有非常重要的意义和研究价值。2 实验材料与方法
13、2.1 主要仪器XLS-3750 立式圆形压力蒸汽灭菌锅：日本三洋公司。 SW-CJ-1F 超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司SIGMA 3K-15 离心机： 德国希格玛（SIGMA）公司冷冻离心机（SAGMA3K15）：美国 sigma 公司QYC-211 全温空气摇床：上海福玛实验设备有限公司Sartrious 电子天平：北京赛多利斯天平有限公司20 l、200 l、1000 l EX 系列移液器：日本立洋（NICHIPET ）公司 血球计数板（2516）：上海医用光学仪器厂光学显微镜：日本奥林巴斯有限公司LRH-250 生化培养箱：上海一恒科技有限公司VITEK-32 全自动微生物鉴定
14、：法国生物梅里埃（biosMerieumx）公司酶标仪（SPECTRAmax Plus348）：美国分子仪器公司（ MDA）自动样品研磨机：上海净信科技公司超低温冰箱：日本 Panasonic 公司旋涡振荡器：海门市其林贝尔仪器制造有限公司氨基酸分析仪 L8900：日本日立公司72.2 试剂NYDB 培养基： 营养肉汤, 8 g/l; 酵母粉, 5 g/l; 葡萄糖, 10 g/l; 121 灭菌20 min，待用；NYDA 培养基：营养肉汤, 8 g/l; 酵母粉, 5 g/l; 葡萄糖, 10 g/l; 琼脂 20 g/l； 121灭菌 20 min，待用；PDB 培养基（马铃薯葡萄糖培养
15、基）：200 g 去皮马铃薯加水煮 30 min 后过滤，滤液中加入 20g 葡萄糖，用蒸馏水定容，至 1000 mL，121灭菌 20 min，待用。PDA 培养基（马铃薯葡萄糖培养基）：200 g 去皮马铃薯加水煮 30 min 后过滤，滤液中加入 20g 葡萄糖，20g 琼脂，用蒸馏水定容，至 1000 mL，121灭菌 20 min，待用。2.3 受试果实选取正常商业成熟度的果实，要求饱满圆润、外观整齐、无干枯、无机械损伤、无病害。受试柑橘品种为椪柑（Citrus poonensis） ，果实采摘于商业成熟期，采摘后立即运往实验室进行处理，或是贮藏在室温（2025）, 相对湿度 92-
16、94%的环境中，48 h 内使用。 17果实预处理步骤为：用 0.1%次氯酸钠(NaOCl) 溶液浸泡消毒 1 分钟左右后，用自来水反复冲洗，最后在室温下晾干，待用。2.4 病原菌试验用病原菌为指状青霉（Penicillium digitatum）和意大利青霉（Penicillium italicum） ， 从当地腐烂的果实上分离。菌种均用 PDA 斜面培养基28培养 7-14 d 后于 4保存待用。从病原菌保存斜面中挑取适量的霉菌孢子，在 PDA 斜面上划线，置于培养箱中，在 28培养 7 天后，用接种环在培养好的霉菌试管斜面上刮取适量孢子，8转移到适量无菌水溶液中，用血球计数板计数，并用无
17、菌水调整至 5104 个/mL，待用。 182.5 拮抗酵母试验用拮抗酵母为本实验室从西藏拉萨地区、那曲县、尼木县和日喀则地区(9111 E, 2997 N，海拔 3500 m)的121份土样中分离得到。土样是在室温为0至10的环境条件下收集后在4下保存待用。1g土样加入100mL无菌水并稀释制成10 -2、10 -3 和10 -4 g/mL浓度梯度，各取100L 涂布于虎红培养基。在28条件下培养3至5天，可根据酵母的形态学特征进行分离和纯化。每个处理3个平行，试验重复2次。分离纯化后的46株菌种均用NYDA斜面培养基28培养3-5d后于4保存待用。这 46 株西藏酵母通过在柑橘上生防效果试
18、验进行初步筛选。将酵母菌株活化后接入含有 50 mLNYDB 的三角瓶中， 28下， 200 r/min 培养 24 h。得到的发酵液在 3000 r/min 下离心 10min，收集菌体，用无菌水洗涤酵母菌体，并用其制成酵母菌悬液，血球计数板计数，用无菌水调整至浓度为 1108 个/mL，待用。用无菌的打孔器在每个果实的赤道部位制造伤口（5 mm3 mm ） ，接种 50 L 酵母细胞悬浮液，3 h 后，再接种 30 L 浓度为 1104 个/mL 扩展青霉孢子悬浮液，晾干。将果实放置于塑料筐中，外套塑料保鲜膜以保持湿度（95左右） 。处理果实分别贮于室温（2025）和低温（0-4）的环境条
19、件下，并于 7 天和 30 d 后观察记录果实的腐烂率和病斑直径。每个处理含有 5个果实，3 个平行，试验重复 2 次。本论文采用的西藏酵母是对柑橘青霉病的抑制率大于40的酵母菌株共5株，分别记作西藏酵母菌株尼木号、胶红1、胶红2、萝卜2号和红叶小召。另外还有一株实验室保藏菌种罗伦隐球酵母（Cryptococcus laurentii (Kufferath) Skinner ） ，该酵母已被证明是一种较好的生防保鲜制剂 18，本论文以其作为阳性对照。这6株酵母均用NYDA斜面培养基28培养3-5d后于4保存待用。92.6 西藏拮抗酵母在柑橘果实体内复筛试验将上述 5 株西藏酵母和实验室罗伦隐球
20、酵母活化后接入含有 50 mL NYDB的三角瓶中，28下，200 r/min 培养 24 h。得到的发酵液在 3000 r/min 下离心10min，收集菌体，用无菌水洗涤酵母菌体 2 次，并用其制成酵母菌悬液，血球计数板计数，用无菌水调整至浓度为 1108 个/mL ，待用。用无菌的打孔器在每个柑橘果实平整面的果皮上制造伤口（5 mm3 mm） ，分别接种 30 L 上述6 种酵母细胞悬浮液，3 h 后，再接种 20 L 浓度为 5104 个/m 指状青霉的孢子悬浮液，晾干。将果实放置于塑料筐中，外套塑料保鲜膜以保持湿度（95左右） 。处理果实分别贮于室温（2025）和低温（0-4）下，并
21、于 4 天和18 天后观察记录果实的腐烂率和病斑直径。每个处理含有 12 个果实，3 个平行，试验重复 2 次。2.7 菌种鉴定利用 26S D1/D2 区间序列测定上述在柑橘果实体内复筛试验得到的一株效果最好的西藏拮抗酵母。采用 Ezup 柱式细菌基因组 DNA 抽提试剂盒（生工生物工程( 上海)股份有限公司）抽提酵母 DNA。利用 Kurtzman 和 Robnett19描述的引物 NL1 5-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3和 NL4 5-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3进行聚合酶链式反应（PCR ） 。萃取得到的 PCR产物由生工生物工程(上海)股份有限公
22、司进行测序。测得的序列在 NCBI 数据库中进行 Blast，进行菌株鉴定(http:/blas- t.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。对所得的基因序列用 MEGA v.5.0 软件包采用邻接法进行系统进化分析 20。参考序列从基因文库中获得。2.8 西藏罗伦隐球酵母在不同温度条件下的防腐保鲜效果将酵母菌株 C. laurentii 活化后接入含有 50 mL NYDB 的三角瓶中， 28，200 rpm 条件下培养 24 h。发酵液在 3000 rpm 下离心 10 min，弃上清液，收集菌体，用无菌水洗涤酵母菌体，并用其制成酵母细胞悬浮液，血球计数板计数，10用无菌
23、水调整至所需浓度，待用。 21选取柑橘果实洗净后置于塑料筐内，用无菌的打孔器在每个柑橘果实平整面的果皮上制造伤口（5 mm3 mm） 。4个处理分别为：（A ）110 6 个/mL C. laurentii；（B）110 7个/mL C. laurentii；（C）110 8 个/mL C. laurentii；（D）110 9 个/mL C. laurentii；对照为无菌水。在每个果实伤口接种30L C. laurentii细胞悬浮液处理液， 3h后，分别接入浓度为 5104 个/mL 扩展青霉或意大利青霉病原菌孢子悬浮液。果实晾干后，用保鲜膜封口以保持湿度（95左右） ，处理果实贮于室温
24、（2025）和低温（0-4）下，并于4天和18天后观察记录果实的腐烂率和病斑直径。每个处理含有 12 个果实，3 个平行，试验重复 2 次。2.9 西藏罗伦隐球酵母不同处理液对柑橘的防腐保鲜效果将酵母菌株 C. laurentii 活化后接入含有 50 mL NYDB 的三角瓶中，28，200 r/min 条件下培养 24 h。发酵液在 3000 r/min 下离心 10 min，收集菌体，用无菌水洗涤酵母菌体，并用其制成酵母菌悬液，血球计数板计数，再用无菌水制备成以下处理液：（1）酵母培养原液：用血球计数板计数，并用滤液调整至浓度为 1108cells/m1；（ 2）酵母细胞悬浮液，培养液在
25、 3000 r/min 下离心 10 min 后，除去上清液，用无菌水洗涤酵母菌体，并用其制成酵母菌悬液，血球计数板计数，用无菌水调整至浓度为 1108 个/mL ；（3）酵母滤液：培养液在 3000 r/min 下离心 10 min 后，取上清液，用无菌滤纸（滤膜 0.45 ）过滤即得；（4）酵母热杀死液：将培养原液在 121下高压灭菌 20 min。参照 zhang 等（2007）方法 22, 23研究 C.laurentii 不同处理液对柑橘采后指状青霉（Penicillium digitatum）和意大利青霉（Penicillium italicum） 的抑制效果。选取柑橘果实洗净后置于塑料筐内，用无菌的打孔器在每个柑橘果实平整面的果皮上制造伤口（5 mm3 mm） 。以无菌水为对照，依次将上述酵母处理液加入果实伤口，各30 L，3 h后，分别接入浓度为 5104 个/mL扩展青霉或意大利青霉病原菌孢子悬浮液。果实晾干后，用保鲜膜封口以保持湿度
