1、中英 HUST-RRes基因工程和基因组学联合实验室基因工程原理何光源2016-3-10中英联合实验室第三章 测序技术p第一节 DNA测序策略p第二节 传统的 DNA序列分析法p第三节 第二代测序技术简介p第四节 第三代测序技术*中英联合实验室造福人类的 HGP人类基因组计划（ Human Genome Project HGP）于 1990年正式启动，其主要目标有：识别人类 DNA中所有基因（超过 10万个）；测定组成人类 DNA的 30亿碱基对的序列；将这些信息储存到数据库中；开发出有关数据分析工具；致力于解决该计划可能引发的伦理、法律和社会问题。人类基因组计划是当代生命科学一项伟大的科学工
2、程，它奠定了 21世纪生命科学发展和现代医药生物技术产业化的基础，具有科学上的巨大意义和商业上的巨大价值。*中英联合实验室第一节 DNA测序策略DNA的测序策略因待测 DNA分子性质、测序方法和测序目的不同而有所不同。在测序之前，必须根据待测序列区的长度，所要求的测序精确度以及现有设施来制定测序总策略。一、已知序列的确证性测序策略二、未知序列的从头测序策略*中英联合实验室一、已知序列的确证性测序策略确证性测序 （ confirmatory sequencing）：对已知的核酸序列进行鉴定和证实；例如：临床分子诊断中，对有遗传倾向的病例检测相关基因有无突变；不仅有助于临床诊断，还有助于探索有关疾
3、病的发病机理及基因突变引起的表型变化。*中英联合实验室一、已知序列的确证性测序策略多数情况下，确证性测序的 DNA片段较小，一套反应即可获得双链 DNA其中一条链上局部区域的核苷酸序列，通常只需对亚克隆于 M13噬菌体或噬菌粒载体上的一段合适的限制酶切片段进行测序；待测 DNA片段位于通用引物的测序范围之内时，可按克隆位点两侧的载体序列设计和合成寡核苷酸片段作为 “ 通用引物 ” ；否则，最好的方法是合成一段长度为 18-20核苷酸的寡核苷酸引物，与距离待测区约 50-100核苷酸的序列互补。*中英联合实验室中英联合实验室中英联合实验室（一）随机测序法鸟枪法 shotgun strategy利
4、用超声处理、核酸酶 （ DNase ）切割或限制性酶切割，将长链 DNA随机断裂成适于测序的片段，把这些DNA片段装入适当载体，建立亚克隆文库，含有子片段的亚克隆扩增后分别进行 DNA序列测定，然后将序列重叠排列，确定待测 DNA的完整序列；该法所获得的序列由许多序列累积产生，结果准确；但由于测序的亚克隆是随机挑选出来，某些序列可能多次重复测定，而一些序列一直不出现，通常要测定比实际靶DNA所含核苷酸多 4 7倍的序列；如果靶 DNA含较多的重复序列，计算机将难以进行分析。*中英联合实验室（二）定向测序法定向测序法 （ directed sequencing）：指从待测DNA片段的某一端开始按顺序进行测序，直至将待测 DNA的序列全部测完；该类方法具有方向性，不会出现大量重复测定的现象；主要包括：嵌套缺失法和引物步入法。*
