1、1消费品中亚硝胺迁移量的测定方法（征求意见稿）编制说明中国检验检疫科学研究院二一八年十月2目 录一、工作简况 .3二、标准编制原则和主要内容论据 .3三、实验室间的方法验证情况 .17四、采用国际标准的程度及对比情况 .17五、与有关的现行法律、法规和强制性国家标准的关系 .17附录 A：方法验证报告.193一、 工作简况（一）任务来源本标准制订工作是按照 2017 年国家标准计划项目消费品中亚硝胺迁移量的测定方法（计划编号：20183052-T-469 ）执行的。本标准主要由中国检验检疫科学研究院负责起草和完成。本标准在编制过程中按照 GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第 1 部分：
2、标准的结构和编写规则的要求以及 GB/T 20001.4-2001标准编制规则 第四部分：化学分析方法中的各项规定而编写，力求符合规范化与标准化的要求。（二）主要工作过程本标准起草单位在充分收集、认真研究相关标准及资料的基础上，结合实验室的条件和本方法的技术特点，对气球、奶嘴等乳胶橡胶类弹性体消费品进行了试验，对样品前处理条件（固相萃取柱类型、洗脱溶剂、洗脱体积等）、气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS）测定条件进行优化，论证了方法的灵敏度、线性范围、回收率、精密度等，建立了消费品中 N-亚硝胺及可亚硝化物质迁移量的测定方法，最后进行方法验证。二、标准编制原则和主要内容论据（一）编制原则本标
3、准方法是根据 GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写规则和 GB/T 20001.4-2001标准编制规则 第四部分：化学分析方法的要求进行编写。（二）标准研制背景N-亚硝胺是一类具有-N-N=O 结构的强致癌有机化合物，迄今为止已发现的 300 多种亚硝胺中约有 90%具有致癌作用。可亚硝化物质指在一定条件下能4够生成 N-亚硝胺的物质，包括亚硝酸盐、氮氧化物和胺类物质（主要是仲胺）等。乳胶制品中的 N-亚硝胺主要产生于乳胶的硫化成型过程。具有仲胺基的硫化催化剂在硫化过程中会给出仲胺，仲胺能与空气中或配合剂中的氮氧化物NOX（主要是 NO2）在酸性环境或催化
4、剂条件下生成稳定的 N-亚硝胺。研究人员曾在婴儿奶嘴、安抚奶嘴、气球、牙齿矫正器的橡皮圈等乳胶制儿童用品中发现亚硝胺及可亚硝化物质。2009 年，欧盟通过玩具安全新指令（2009/48/EC），规定供 3 岁以下婴儿使用的玩具和供儿童放入口中的玩具严禁使用亚硝胺，如若工艺过程实在无法避免，其总亚硝胺的迁移量也不得高于0.05 mg/kg，总可亚硝化物质的迁移量不得高于 1 mg/kg。该指令已于 2009 年7 月 20 日正式实施，2011 年 7 月 20 日起新投放市场销售的产品应符合新指令中除化学品要求之外的所有规定，而自 2013 年 7 月 20 日起新投放市场销售的产品需符合化学
5、品要求的规定。与该指令配套的欧盟协调标准 EN71-12 要求至少检测 13 种 N-亚硝胺，包括脂肪族亚硝胺、脂环族亚硝胺及芳香族亚硝胺。目前 N-亚硝胺常用的检测方法有气相色谱-热能分析仪联用法（ GC-TEA）、气相色谱- 电子轰击源单级质谱法（GC-EI-MS）、气相色谱-电子轰击源串联质谱法（GC-EI-MS/MS）、气相色谱 -化学源单级质谱法（ GC-CI-MS）、气相色谱-化学源串联质谱法（GC-CI-MS/MS）、液相色谱法（HPLC）和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)。现有国内外检测标准均采用基于气相色谱-热能分析仪或液相色谱-串联质谱的检测方案。如欧盟 EN 12
6、868:2017 采用气相色谱-热能分析仪测定奶嘴中 13 种亚硝胺迁移量；欧盟 EN71-12:2016 采用液相色谱-串联质谱法测定玩具中 13 种亚硝胺迁移量；我国 GB 5009.26-2016 采用气相色谱-质谱法和气相色谱- 热能分析仪法测定食品中 N-二甲基亚硝胺；我国 GB 28482-2012 采用气相色谱-热能分析仪法测定婴幼儿安抚奶嘴中亚硝胺；我国 GB/T 24153-2009 采用气相色谱-质谱法测定橡胶及弹性体材料中 12 种亚硝胺。上述方法中，气相色谱-热能分析仪只能专用于亚硝胺检测，实验室普及率低，应用受到一定限制。GC-CI-MS 主要依靠准分子离子峰进行定性
7、，样品基质复杂时，易受到干扰而产生假阳性。同样的，GC-EI-MS 在处理复杂基质的样品时难以对低分子量 N-亚硝胺进行准确的定性及定量分析。GC-CI-MS/MS抗背景干扰能力强，但 CI 源电离率低，有时候采用串接质谱并不能很好地提高5灵敏度，且 CI 源通常需要在低温条件工作，离子源易受污染。HPLC 的紫外检测器对 N-亚硝胺特异性不强，常需要对 N-亚硝胺进行衍生，操作繁琐。LC-MS/MS 灵敏度高，定性准确，但该设备昂贵（200 万400 万），实验中消耗大量有机溶剂，且在测定挥发性的亚硝胺时，分离度及灵敏度略逊于气相色谱-串联质谱。GC-EI-MS/MS 结合了气相色谱分离度好
8、的特点与串联质谱灵敏度高、背景干扰小的优势，近年来在化妆品、气球、环境水中 N-亚硝胺的检测中得到了一定的应用。本标准草案建立基于 GC-EI-MS/MS 的亚硝胺测定方法与先前相关研究的改进主要体现在两个方面，一是通过对固相萃取过程的优化，使其更适应于消费品中 N-亚硝胺迁移量的测定，二是通过对分离及测定条件的优化，将方法适用的 N-亚硝胺种类由脂肪族亚硝胺、脂环族亚硝胺扩展到芳香族亚硝胺，同时检测的 N-亚硝胺数量增加到了 15 种。（三）标准技术路线及条件优化1. 方法概述本标准涉及以乳胶、橡胶等弹性体为材质的消费品中 15 种 N-亚硝胺及可亚硝化物质物质迁移量的气相色谱-串联质谱检测
9、方法。试样用人工唾液迁移提取，迁移溶液经固相萃取净化浓缩，样液用气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）进行测定，采用多反应监测模式（MRM）进行定性和外标法定量。本标准方法对样品前处理条件（固相萃取柱类型、洗脱溶剂、洗脱体积等）、气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS）测定条件进行研究试验，还进行了回收率试验、精密度试验以及方法验证试验，各项结果表明，本标准方法的分析性能指标能够符合分析要求，可以满足消费品中 N-亚硝胺及可亚硝化物质含量的测定要求。2. 色谱和质谱条件的优化本标准的优化实验采用气相色谱-串联质谱仪完成。2.1 色谱柱的优化本标准选择常用的气相色谱柱，考察其对亚硝胺物质的色谱分
10、离效果，分别考察了 HP-5MS UI（30m0.25mm，0.25m）、DB-624（30m0.25mm，1.4m）、DB-1701(30m0.25mm，0.25m）、HP-6INNOWax 色谱柱 (30m0.25mm，0.25m ）对 15 种亚硝胺的分离效果，结果表明 DB-624 的分离效果最好，其次是 HP-5MS UI。但 DB-624 色谱柱对沸点较高的目标物响应不好，如 N-亚硝基二环己胺（沸点 340.26 ）、N-亚硝基二苯胺（沸点 359.13 ）、N-亚硝基二苄胺（沸点 382.34 ），因此本研究中选择了HP-5MS UI 柱。2.2 柱温升温速率的优化本标准涉及的
11、化合物大多为同系物，数目较多，并且存在同分异构体，沸点非常相近，为了获得好的分离效果，需要优化色谱条件，尤其是柱温的升温速率。由于 N-亚硝基二甲胺和 N-亚硝基甲基乙基胺沸点分别为 153和154.4，初温过高会影响分离度，因此采用初温 50保持 3 min。同时 N-亚硝基甲基乙基胺响应较低，峰形前伸，因此在其保留时间附近快速升温，5080范围内升温速率为 30/min，改善其峰形。N- 亚硝基甲基苯胺、N- 亚硝基吗啉和 N-亚硝基二丙胺沸点分别相差 20，但分子结构中的官能团影响了它们在色谱柱中的保留行为，三者保留时间几乎相同；为了最大程度地分离这三种物质，采用 80保持 7 min。
12、超过 80以后，HP-5 MS UI 色谱柱对其他物质分离效果均较好，仅为缩短分析时间对升温速率进行一些调整。最终选择的升温程序为： min)5(240210min)3(10in)7(80min)3(50 in/in/40in/20in/ 2.3 质谱条件的优化接着筛选母离子、优化碰撞能量等质谱参数，建立 MS/MS 方法，使 15 种亚硝胺物质的母离子与特征碎片离子产生的离子对强度达到最大。质谱接口温度为 250 ；电离方式为 EI+，电离能量为 70 eV。需要指出的是，N-亚硝基二苯胺热稳定性较差，在进样口发生热分解反应，之后分离检测的均为其降解产物二苯胺。最终得到的气相色谱-串联质谱测
13、试条件见表 1，各 N-亚硝胺的保留时间、定性及定量离子对见表 2。表 1 GC-MS/MS 仪器工作条件的确定色谱柱 HP-5 MS UI （30m0.25mm，0.25m）载气 He（纯度99.999%），流速 1.0 mL/min碰撞气 Ar（纯度99.999% ），碰撞气压 0.32 Pa进样口温度 280 7进样方式 不分流进样进样量 1 L程序升温 min)5(2401min)3(0in)7(80min)3(50 in/i/40i/2i/ 定性方式 MRM定量方式 MRMEI 电子能量 70 eV离子源温度 180 传输线温度 250 溶剂延迟 3 min表 2 N-亚硝胺的保留时
14、间、定性及定量离子对序号 N-亚硝基胺名称 英文名称及简称保留时间定量离子对， m/z(碰撞能量 /eV)定性离子对， m/z(碰撞能量 /eV)1 N-亚硝基二甲基胺 NDMAN-nitrosodimethylamine 3.67 74.0 44.0 (3) 74.0 42.1 (10)2 N-亚硝基甲基乙基胺 NMEAN-Nitroso-methyl-ethylamine 4.60 88.1 71.1 (3) 88.1 57.1 (7)3 N-亚硝基二乙基胺 NDEAN-nitrosodiethylamine 5.65 102.1 85.1 (3) 102.1 56.1 (11)4 N-亚
15、硝基二异丙胺 NDiPAN-nitrosodiisopropylamine 8.62 130.15 88.13 (4) 130.15 71.1 (10)5 N-亚硝基-N-甲基苯胺 NMPhAN-nitroso-N-methyl-N-phenylamine 10.51 106.0 77.0 (14) 106.0 51.1 (25)6 N-亚硝基吗啉 NMORN-nitrosomorpholine 10.70 116.0 86.1 (2) 116.0 56.1 (9)7 N-亚硝基二丙基胺 NDPAN-nitrosodipropylamine 10.90 130.15 113.2 (3) 130
16、.15 71.1 (12)8 N-亚硝基哌啶 NPIPN-nitropiperidine 12.17 114.1 84.1 (5) 114.1 97.1 (5)9 N-亚硝基-N-乙基苯胺 NEPhAN-nitroso-N-ethyl-N-phenylamine 12.71 121.1 106.1 (13) 121.1 77.1 (26)10 N-亚硝基二异丁基胺 NDiBAN-nitrosodiisobutylamine 13.39 115.1 84.1 (2) 141.1 85.1 (7)11 N-亚硝基二丁基胺 NDBAN-nitrosodibutylamine 15.32 116.1
17、99.1 (2) 158.2 99.1 (9)12 N-亚硝基二苯基胺 NDPhAN-nitrosodiphenylamine 19.38 169.1 168.2 (10) 169.1 167.2 (15)13 N-亚硝基二环己胺 NDCHAN-Nitrosodicyclohexylamine 20.57 129.0 83.2 (7) 210.0 128.2 (7)14 N-亚硝基二苄基胺 NDBzAN-nitrosodibenzylamine 21.27 181.1 103.1 (16) 181.1 165.2 (16)815 N-亚硝基二异壬胺 NDiNAN-nitrosodiisonon
18、ylamine 21.43 169.2 99.15 (9) 169.2 113.2 (5)分别取标准工作溶液和样品溶液，在相同实验条件下进行测试。如果样品溶液中待测物质的定性、定量离子对保留时间与标准溶液中对应的保留时间偏差在2.5 之内，则可判定为样品中存在对应的待测物。2.4 总离子流出色谱图在优化的实验条件下，15 种 N-亚硝胺的 MRM 总离子流出图如图 1 所示。46810214618200240680120 5143892765431 /min图 1 15 种 N-亚硝胺标准溶液的 MRM 色谱图（1 mg/L）分析物：1. NDMA; 2. NMEA; 3. NDEA; 4.
19、NDiPA; 5. NMPhA; 6. NMOR; 7. NDPA; 8. NPIP;9. NEPhA; 10. NDiBA; 11. NDBA; 12. NDPhA; 13. NDCHA; 14. NDBzA; 15. NDiNA3. 溶剂效应二氯甲烷、乙醇、丙酮、正己烷、甲醇常用于配置 N-亚硝胺标准溶液，本标准研究过程中发现 N-亚硝胺对不同溶剂存在溶剂效应。准确移取 200 L混合标准储备液于 10 mL 棕色容量瓶，分别用二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、正己烷、甲醇、乙醇定容（n=3 ），配置不同溶剂的 1 mg/L 的 N-亚硝胺标准溶液，上机检测。将峰面积最大的溶剂设为 100%，其他
20、溶剂的峰面积与其相比计算相对百分比，如图 2 所示。结果表明，溶剂种类对 N-亚硝胺响应强度及色谱峰形具有显著影响，其中乙酸乙酯作为溶剂时目标物的响应值最高（见图 2），且色谱峰形最好（见图93）。本标准中的 15 种待测 N-亚硝胺的正辛醇-水分配系数（ lg Kow）范围为-0.643.90，从水溶性到油溶性都有分布，二氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷、丙酮、甲醇、乙醇的 lg Kow 值依次为 1.34、0.86、3.29、-0.24、-0.63 和-0.14，即正己烷和二氯甲烷为亲油性，乙酸乙酯为亲油性同时有一定亲水性，丙酮、甲醇、乙醇为亲水性。乙酸乙酯的溶剂效应最好，可能因为乙酸乙酯对水溶性
21、和油溶性的目标物质均能较好地溶解。正己烷的亲油性较强，对水溶性的 NDMA 溶解性较差，导致了该物质几乎无响应的现象。二氯甲烷为亲油性，对水溶性的NDMA 存在拖尾并且峰展宽的色谱行为。因此选择乙酸乙酯作为标准工作液稀释溶剂。图 2 15 种 N-亚硝胺对 6 种不同溶剂的响应差异分析物：1. NDMA; 2. NMEA; 3. NDEA; 4. NDiPA; 5. NMPhA; 6. NMOR; 7. NDPA; 8. NPIP;9. NEPhA; 10. NDiBA; 11. NDBA; 12. NDPhA; 13. NDCHA; 14. NDBzA; 15. NDiNA10图 3 6 种
22、不同溶剂对 NDMA 的色谱峰形影响（1 mg/L）4. 固相萃取柱条件的优化4.1 固相萃取柱的选择接下来考察了固相萃取对 N-亚硝胺的回收效果。首先，分别考察了不同类型的固相萃取柱：活性炭柱（Sep-Pak AC-2、ENVI-carb），两性基团柱（ Chromabond Easy、Oasis HLB）和 C18 柱（Sep-Pak C18、Orochem C18）对待测 N-亚硝胺的保留效果。在 10 mL 空白人工唾液中加入 N-亚硝胺混合物，使其添加浓度为 0.5 g/mL，经固相萃取后，收集柱后流出液，用 10 mL 二氯甲烷液液萃取，萃取液直接上机检测。结果如表 3 所示，EN
23、VI-carb、Sep-Pak C18、OROCHEM C18 和 Oasis HLB 柱的流出液中可直接检测到目标物，即这 4 种固相萃取柱对目标物的保留较弱。Chromabond Easy 和 Sep-Pak AC-2 柱后流出液直接检测未检出目标物，将其氮吹浓缩到 1 mL 上机检测，Chromabond Easy 检测到极少量分析物， Sep-Pak AC-2 未检出。结果表明，两性基团小柱 Chromabond Easy 和活性炭小柱 Sep-Pak AC-2 对目标分析物的保留能力较强，选择这 2 种固相萃取柱进行进一步的条件优化。表 3 6 种固相萃取柱后流出液中 N-亚硝胺含量(n=3)萃取液直接检测峰面积 萃取液浓缩后峰面积物质 1 2 3 4 5 6 5 6NDMA 331651.4 3958.524.7 4067.524.7 1756.5143.5 ND ND ND NDNMEA 144525.3 251794.8 4769194.5 ND ND ND ND ND
