1、单克隆抗体(McAb)制备技术1975 年 Khler 和 Milstein 首次利用杂交瘤技术生产单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb)获得成功，开创了免疫学和分子生物学研究的新纪元，被人们誉为“免疫学中的一场革命”，该项技术具有巨大生命力和发展前景，目前已被成功地用于分子生物学、免疫学、细菌学、病毒学、生物化学、遗传学、药物学等许多领域的研究。下面以抗空肠弯曲菌共同抗原McAb 的制备为例，介绍 McAb 的制备技术。一、 材料和方法(一) 材料 1 PRMI1640 培养液 PRMI1640 培养基粉 104g ，双蒸馏水1 000ml ，抽滤或高压蒸气灭菌，每瓶
2、 80ml 分装。2 完全 PRMI1640 培养液 PRMI1640 培养液 80ml,1mol/L Hepes 2ml,02mol/L 谷氨酰胺 1ml，青、链霉素溶液(1000u/ml)1ml，灭活小牛血清 20ml。3 次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷(HT 母液100)次黄嘌呤 1361mg ，胸腺嘧核苷 387mg ，蒸馏水加至 100ml。在 4550水浴中溶解，过滤除菌，分装小试管，每支 5ml，置-20 中保存。4 氨基喋呤(A 母液100)氨基喋呤 176mg ，蒸馏水 90ml，1mol/L NaOH 05ml ，加蒸馏水至 100ml，再加 05ml 1mol/L HCl 中和，
3、过滤除菌，分装小试管，每支 5ml，置-20中保存。5 HAT 选择性培养基完全 PRMI1640 培养液 100ml,100HT 母液 1ml，100A 母液1ml。用 5%NaHCO3 调整 pH 值至 74 左右。6 HT 培养液完全 RPMI1640 培养液 100ml，100HT 母液 1ml。用 5%NaHCO3 调整pH 值至 74 左右。7 50%聚乙二醇(PEG)溶液将 PEG(MW4 000) 放在试管内加盖，1213 高压蒸气灭菌20min。使用前加入等量的 pH 值 82 无血清培养液，置 56混合，直至完全溶解，移置 37备用。8 8 氮杂鸟嘌呤称取 8 氮杂鸟嘌呤
4、20mg，溶于 4mol/L NaOH 10ml 或036%Na2CO310ml 中，以蒸馏水稀释至 1000ml，过滤备用。9 台盼蓝溶液台盼蓝 100mg，溶于 PBS 100ml 中即成。10 034mol/L 蔗糖溶液蔗糖 58g ，蒸馏水 50ml，高压蒸气灭菌，分装。(二) 方法(以空肠弯曲菌共同抗原的单抗制备为例)1 动物免疫将提取的空肠弯曲菌共同抗原(CA)与等量的福氏完全佐剂乳化，以皮下多点及腹腔注射途径对 8 周龄左右的 BALB/c 小鼠(雌雄不限)进行基础免疫，间隔 14 天后，改为福氏不完全佐剂，追加免疫，14 天后再免疫一次，于融合前 3 天，经尾静脉用水剂抗原加强
5、免疫一次。每次抗原用量为每只鼠 2550g。2 细胞悬液的制备(1) 骨髓瘤细胞：在进行细胞融合前的 48h，用含 10%小牛血清 1640 培养液，将供融合用的骨髓瘤细胞(NS1 或 SP2/0)作增殖培养。融合前 24h 再以同样培养液将骨髓瘤细胞培养物换液 1 次，使细胞浓度于融合当天达到对数生长期的 105 细胞/ml，取数瓶骨髓瘤细胞，轻轻倒去瓶内原有培养液，加入无血清 1640 培养液少许，用毛细管吹打瓶壁数次，将细胞洗下(如用冷的 1640 培养液冲洗瓶壁细胞更容易洗下)。将骨髓瘤细胞悬液一并收入离心瓶中，悬浮于 1640 培养液中，轻轻混匀，吸出少量培养液进行细胞计数，并用台盼
6、蓝染色观察死活细胞率，成活细胞应高于 90%。细胞悬液以1 000 r/min 离心 10min，倾去上清液，再悬于无血清的 1640 培养液中供融合用。(2) 免疫小鼠脾细胞：取上述加强免疫后 34 天的小鼠，挖去眼球放血，收集血液，离析血清，供检测抗体效价用。然后拉颈处死，用 75%酒精将小鼠浸泡消毒，立即放超净台内，用消毒剪刀剪开小鼠腹腔，取出脾脏。用 pH 值 74 无血清 1640 培养液将脾脏冲洗，立即用镊子将脾脏放在消毒铜网上，置于玻璃培养皿内，然后倒入少量 1640 培养液，用 5ml 针筒芯子研磨脾脏使成浆状，将此吸入尖底刻度离心管内，于冰浴中静置 510min，待大块脾组织
7、下沉到底部，轻轻吸出上层脾细胞悬液，移入另一刻度离心管内，悬浮于 30ml 1640 培养液中。轻轻混匀，吸取少量溶液，进行细胞计数及活力检查，活细胞率不应低于 90%。以1 000 r/min 离心 10min，倒去上清，将底层脾细胞再悬浮于少量无血清 1640 培养液中。取脾细胞的方法，除了在铜网上研磨外，还可用两个注射针头轻轻向一个方向将细胞从脾膜内梳刮下来，或在脾包膜上刺几个孔，然后用针头注入培养液，将细胞冲洗出来；或用剪刀反复将脾脏剪碎，以获得脾细胞。(3) 小鼠腹腔巨噬细胞：取 12 周龄以上，最好是与骨髓瘤同系小鼠(其他小鼠也可)，先挖去一只眼球放血，待血滴不出为止。放血的目的是
8、避免取腹腔细胞时腹腔内出血，造成大量红细胞混入饲养细胞内。若小鼠不死，则可拉颈处死，浸入 75%酒精中消毒，随即放入超净台内，用消毒镊子和剪刀剪开小鼠腹部外层皮肤，剪时要小心，切勿将腹膜剪破，使腹腔内液体流失。然后向上、下两侧方向拉开腹部皮肤，暴露腹膜。用消毒注射器抽取034mol/L蔗糖溶液(或无血清 1640 培养液)4ml 用镊子将腹膜提起，将溶液注入小鼠腹腔内。一只手固定针筒，针头停留在腹腔内，轻轻按摩腹壁 12min，目的是促使巨噬细胞游出。然后用注射器抽回腹腔内液体，也可用毛细吸管将液体吸出，注入到预先置于冰浴中的尖刻度离心管内，置冰浴的目的主要是可以避免或减少玻璃管壁对巨噬细胞的
9、吸附作用。若用塑料离心管则可减少细胞吸附。细胞悬液以1 000 r/min 离心 10min，倒去上清液，加入含 20%小牛血清 1640 培养液中。通常每只小鼠可获得 35106 个腹腔巨噬细胞。把沉淀细胞悬浮于20ml 培养液中，混匀，分注于 2 块 96 孔(或 4 块 40 孔)培养板中，每孔 01ml( 约 2 滴)，培养板加盖后，放入 37含 5%10%CO2 培养箱中培养。24h 后，可以放在倒置显微镜下观察。生长良好的饲养层，巨噬细胞或小淋巴细胞的胞体饱满，折光性强，部分或大部分细胞变成棱形。腹腔细胞培养物保持在良好的潮湿温箱内，至少可在 7 天内保持活力。饲养层细胞经 24h
10、 培养后，若细胞形态变小，无光泽，视野中不见棱形细胞，则不能供融合细胞的培养用。其原因可能是细胞培养板处理不当，或培养基中含有毒性物质，或培养条件不适(pH 值、湿度、CO2 等)所造成的。加入巨噬细胞的作用，是由于杂交瘤细胞早期十分脆弱，细胞稀少时不易生长，加入一些巨噬细胞、胸腺细胞或脾细胞，满足了杂交瘤细胞对密度的依赖性，消除一些有毒或有抑制生长作用的细胞碎片，提供生长刺激因子等，促进杂交瘤细胞的生长。饲养细胞中，除巨噬细胞外，胸腺细胞、脾细胞均具有较好的效果。3 细胞融合的步骤细胞融合过程在 37水浴箱内进行，并要求严格的无菌操作。(1) 混合细胞：将上述制备的脾细胞和瘤细胞按细胞数的
11、2101 混合于刻度离心管，经1 000 r/min 离心 10min，倾尽上清液，用力振动试管，将细胞打散，使细胞沉淀块疏松成糊状。(2) 加入 PEG：将离心管直立于操作环境中，在 90s 内滴加完 50%PEG 溶液 05ml，边加边摇动，加完后，静置 90s。(3) 终止 PEG 的作用：用无血清 1640 培养液终止 PEG 的作用。仍在边摇晃的情况下，在第一个 30s 内滴加 1ml；在下一个 30s 滴加 3ml，在最后 90s 内滴加 16ml。加入培养液后，不要多摇动，以免影响细胞融合率，最后补充培养液至 3040ml，在室温中静置5min。(4) 离心洗涤：以1 000 r
12、/min 离心沉淀 10min，弃去上清液。加满无血清培养液，再离心 10min，弃去上清液，以洗除残余的 PEG。(5) 加入培养孔内：把沉淀细胞用含 20%小牛血清的 HAT 培养液 50ml 混匀，分别加入到 5 块 96 孔培养板中，每孔 01ml ，每孔原有 01ml 饲养细胞，故现在每孔有02ml培养液。将培养板置于 37含 5%10%CO2 培养箱中培养。(6) 对照孔：第一行孔中为用 15%小牛血清 HAT 液稀释的骨髓瘤细胞，细胞数约 1105/ 孔。骨髓瘤细胞在 23 天可见明显退变，如果不退变则表明 HAT 失效，或者细胞已由HGPRT-回复成 HGPRT+ 。第二行孔中
13、为用 15%小牛血清 HAT 液稀释的脾细胞，细胞数 4105/ 孔。脾细胞在 67天后也会见到退变现象，在上清液中有时可检测出抗体，这是脾细胞分泌出来的，随着换液，抗体浓度会愈来愈低，以至消失。如果脾细胞继续旺盛增殖，而且抗体浓度不降低，有两种可能性：一种是在换液时混入杂交瘤细胞，另一种是脾细胞本身可能在小鼠体内转化成能长期培养的免疫母细胞，这种可能性是很小的，一旦遇到应抓住不放，将它克隆化。可取少量细胞融合悬液，于显微镜下观察细胞融合情况。可能出现几种情况：未融合的脾细胞；未融合的骨髓瘤细胞；脾细胞与脾细胞的融合体；瘤细胞与瘤细胞的融合体；脾细胞与骨髓瘤细胞的融合体，通过显微镜下观察，可粗
14、略地了解融合的情况及融合过程中细胞的破损率 。4 融合后混合细胞的培养(1) 换液：在培养过程中，通常按半量换液法(即吸去每个孔 1/2 体积的培养液，再加入 1/2 体积新鲜的 HAT 培养液)换液，每次从每孔中吸出 01ml 培养液，加上 01ml 新鲜的HAT 培养液。第 5、8 及 11 天换以 20%小牛血清 HAT 液，第 14、18、22、25 天换以 20%小牛血清 HT 液。这要根据实际情况来决定，如果发现培养液变黄，应及时换液，特别是后期细胞克隆较大的，一般隔日换液一次。换液时，应首先换对照孔，以免将杂交瘤细胞及抗体带入对照孔中。严格说，吸出上清液时，每孔只许用一个吸头，这
15、样才不致于把一个孔中的细胞及抗体带入另一孔中，也可避免污染扩散。(2) 观察：每天都应观察，一是看是否有污染，二是看细胞生长状态。一般经过 35 天培养，单个的杂交瘤细胞开始长成几个或十几个细胞的集落，大多数在 810 天时形成，个别至两周左右才能见到。5 抗体阳性孔的检测当杂交瘤细胞的大小达到孔底面积的 1/10 时，就可检测上清液中的抗体，筛选出分泌抗体的杂交瘤细胞，并尽早进行克隆化。不分泌抗体的杂交瘤细胞比分泌抗体的杂交瘤细胞生长得快，由于培养液中的营养有限，分泌抗体的杂交瘤细胞有被挤掉的危险，因此要早检测、早克隆。第一次检测抗体一般在第二次换液的两天后，即融合后的第 10 天进行。过早
16、检测，由于杂交瘤细胞太小，分泌抗体少，易出现假阴性；也可能由于免疫脾细胞分泌的抗体仍存在，出现假阳性反应。因此必须同时检测脾细胞培养孔作为对照。第二次检测杂交瘤细胞培养上清液中抗体的方法，可以根据抗原的性质和需要的灵敏度来选择。常用的方法有酶联免疫吸附测定法、间接血凝试验、免疫荧光技术、放射免疫测定等。在制备抗空肠弯曲菌 CA 的 McAb 中，应用间接 ELISA 进行杂交瘤分泌的 McAb 的检测。其主要过程：将提取的 CA 用 pH 值 96 碳酸盐缓冲液作适当稀释后，包被酶联反应盘，先置 37 1h，再于 4冰箱包被过夜。次日用 pH 值 74PBS( 含 01% 吐温 20)洗涤 3
17、 次。检测时加入被测上清液，37感作 1h，洗涤后，加入 HRP 兔抗鼠 IgG 结合物，继续在 37感作 1h，洗涤，加入底物溶液，室温下避光显色 15min，终止反应后，测 OD 值，以被测孔的 OD 值高于NS1 骨髓瘤细胞培养上清液对照 OD 值的 4 倍以上定为阳性。6 杂交瘤细胞的克隆化克隆化的目的是为获得来自单一细胞的群体，是获取纯净均一的McAb 不可缺少的步骤，也是得到稳定的杂交瘤细胞株的重要措施。早期杂交瘤细胞是很不稳定的，容易丢失染色体而变成非分泌抗体型，而且阳性株转变为阴性株，一般阴转率为 50%；强阳性株也可以变成弱阳性株(由于分泌抗体减少或者其抗体的亲和力转弱)。就
18、是经长期培养的杂交瘤细胞株也可能出现上述情况，只有通过早期克隆化及不断克隆化来选择稳定细胞株，以保证杂交瘤细胞长期稳定分泌抗体的功能。克隆化最常用的方法是液相有限稀释法、软琼脂法、显微镜操作法及应用荧光激活细胞分离仪等。下面介绍液相有限稀释法及软琼脂法。(1) 液相有限稀释法：取小鼠腹腔细胞悬浮于 HT1640 培养液中，制备饲养细胞层；用毛细管将培养孔中的细胞轻轻吹打下来，并用相同培养液重复操作数次；于血细胞计数板上作细胞计数，然后用 HT1640(含 20%小牛血清)调整细胞数；初次克隆化应选择三个稀释度，即每孔(01ml) 分别含有 100 个、10 个、1 个细胞，分别加于预制的含小鼠
19、饲养细胞层的 96 孔细胞培养板中，每孔 01ml ，置 37含 5%10%CO2的培养箱内培养。如果该杂交瘤生长能力弱，耐性小，有可能在 100 个细胞/孔得到克隆；第 5 天起，每天都应观察，对每孔中的细胞群落数进行记录，并对克隆化的培养孔上清液进行检测，对强阳性孔中的细胞做扩大培养。同时也应检测数个含有多个细胞群落的孔中的上清液，以备在已克隆化的孔均为抗体阴性时，可将多克隆的阳性孔再做克隆化；再次克隆化，要得到一个稳定分泌抗体的细胞株，一般要经 23 次克隆化。再次克隆化的方法与初次基本相同，也应加饲养细胞，细胞稀释度可用两个，即 510 个细胞/孔及 1 个细胞/孔。(2) 软琼脂平板
20、法：于 6cm 或 9cm 的无菌平皿内，以小鼠腹腔细胞贴壁，然后加入 20%琼脂 双倍浓度 HT 细胞培养液(11)，铺于皿底，使其凝固；制备细胞悬液，将 1 份细胞与 2 份琼脂HT 细胞培养液混合，铺于上层；凝固后，置 37含 5%10%CO2 的温箱中培养。细胞集落在 10 天左右形成，可将克隆挑出继续进行克隆。7 阳性杂交瘤细胞株的扩大培养、冻存、复苏当获得 1 株阳性杂交瘤细胞时，要及时进行扩大培养、冻存，以防细胞株丢失。(1) 扩大培养：一般在检测到分泌特异抗体的阳性杂交瘤克隆时，为了严防差错，第 2 天必须重复检测 1 次上清液。同时取 1 只小鼠腹腔细胞，制备两瓶(5ml 培养液/瓶)饲养细胞。饲养细胞配于含 20%小牛血清的 1640 培养液中培养 1824h，再将阳性杂交瘤细胞克隆孔内的细胞轻轻吹打下来，吸入含饲养细胞的培养瓶内，继续扩大培养。(2) 移入小鼠腹腔：取同系小鼠(即与杂交瘤的骨髓瘤细胞属同一品系的)，在其腹腔内注射05ml 液体石蜡油或降植烷，过 37 天后，可供细胞移入。将阳性克隆孔内的细胞轻轻吹打下来，配于 05ml1640 培养液或生理盐水中，注入预先注射过石蜡油或降植烷的小鼠腹腔内。(3) 液氮冻存：把阳性细胞株冻存起来，是避免细胞中途丢失的最佳方法。
