1、重庆医科大学本科生毕业论文论文题目MALDITOFMS对临床分离病原菌的鉴定评估作者姓名年级2011级专业生物技术论文答辩年月2015年6月二一五年六月指导教师姓名职位大客户经理单位名称XXX诊断产品（XX）有限公司1目录中文摘要2英文摘要3MALDITOFMS对临床分离病原菌的鉴定评估4前言41材料与方法511主要方法512主要试剂和培养基513主要仪器514病原菌培养515样品处理62结果处理63讨论104结论11参考文献12开题报告14致谢152MALDITOFMS对临床分离病原菌的鉴定评估摘要目的评估MALDITOFMS对临床分离病原菌的鉴定可靠度。方法收集了广东省某三甲医院各临床科室
2、的标本进行病原菌培养，对培养出的可疑病原菌同时用VITEKMS和VITEK2COMPACT两种系统进行鉴定，对两种方法有不同结果的病原菌进行16SRRNA测序，测序的结果为金标准，比较VITEKMS对病原菌的准确鉴定率相对于常规方法有何变化。目前VITEK2系统覆盖了全国约60的医院，已经成为微生物实验室的常规自动化检测系统。结果用MALDITOFMS和常规VITEK2COMPACT的方法有9489258株病原菌鉴定结果完全一致，VITEKMS将9679443株细菌鉴定到种的水平，与常规的VITEK2COMPACT系统的鉴定率（9375）无明显差异。结论MALDITOFMS是一种快速、简单、准
3、确、低成本的鉴定方法，有望在未来取代常规的微生物鉴定。关键词MALDITOFMS；病原微生物；鉴定3EVALUATIONOFMASSSPECTROMETRICIDENTIFICATIONOFPATHOGENSROUTINELYISOLATEDINACLINICALMICROBIOLOGYLABORATORYUSINGMALDITOFMSABSTRACTOBJECTIVETOEVALUATETHERELIABILITYOFIDENTIFICATIONWITHMALDITOFMSINCLINICALISOLATESMETHODWECOLLECTEDSPECIMENSINATERTIARYHOSPI
4、TALOFGUANGDONGPROVINCEFORPATHOGENCULTUREANDSUSPECTEDPATHOGENSWEREIDENTIFIEDWITHVITEKANDVITEK2COMPACTSIMULTANEOUSLYDISCORDANTRESULTSWERERESOLVEDWITH16SRDNAGENESEQUENCING,WECOMPAREDTHEIDENTIFICATIONACCURACIESBYMALDITOFMSWITHCONVENTIONALPHENOTYPICIDENTIFICATIONOFPATHOGENSCURRENTLY,VITEK2SYSTERMSHAVEBEE
5、NCOVERED60HOSPITALSINCHINA,HAVEBECOMEAUTOMATICDETECTIONSYSTEMINAROUTINEMICROBIOLOGYLABORATORIESRESULTSTHEIDENTIFICATIONRESULTSAREIDENTICALIN9489258STRAINSTHEREARE9679443STRAINSIDENTIFYINGTOSPECIES,NOSIGNIFICANTDIFFERENCEINTHERATEOFCONVENTIONALIDENTIFICATIONVITEK2COMPACTSYSTEM9375CONCLUSIONMALDITOFMS
6、ISAFAST,SIMPLE,ACCURATEANDCOSTEFFECTIVEIDENTIFICATIONMETHODS,ISEXPECTEDTOREPLACETHECONVENTIONALMICROBIALIDENTIFICATIONINTHEFUTUREKEYWORDSMALDITOFMSPATHOGENSIDENTIFICATION4MALDITOFMS对临床分离病原菌的鉴定评估前言病原微生物引起的感染性疾病是危害人类健康，导致患者死亡的重要原因之一。目前常规的微生物鉴定主要还是传统的鉴定方法，依赖于常规培养，分离和生化鉴定。传统方法一般需要依赖于微生物的活性代谢过程，因此需要一个较长的
7、培养过程【1】。而临床微生物检测需要对感染患者的检测样本进行快速鉴定以提供给临床医生对症治疗，所以传统方法明显不能满足临床检测的需求。另外分子生物学的方法，像核糖体基因测序、实时定量PCR、基因探针等可以快速检测病原微生物，但是这种方法操作复杂、成本高，很难在临床微生物室常规开展【2】。为了满足临床的需求，迫切需要建立一种简便、快速、准确、经济的病原微生物鉴定方法。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术（MATRIXASSISTEDLASERDESORPTION/IONISATIONTIMEOFFLIGHT，MALDITOFMS）是新发展起来的快速准确的微生物鉴定方法，已经被越来越多的用在临床微
8、生物室。微生物质谱鉴定技术是微生物蛋白组学与基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术相结合的革命性突破。质谱（MASSSPECTROMETRY，MS）作为一种分析手段已出现几十年，1975年质谱技术就已初步用于细菌的快速鉴定，但直到1988年基质辅助激光解吸电离、电喷雾电离等软电离技术的出现才得到进一步快速发展【3】。2O世纪8O年代后期发展的“软电离”技术使得质谱分析技术能够用于生命科学研究领域，软电离技术能够保持大分子或分子复合物在研究分析过程中的完整性【4】。MALDITOFMS的发展，使得质谱技术在微生物的鉴定中有了全新快速的发展。目前市场上主要有两家公司的产品，生物XXX的VITEKMS
9、、VITEKMSRUO、VITEKMSPLUS系统（MARCYIETOILE法国）和布鲁克道尔顿的MALDIBIOTYPER系统（BREMEN，德国），因此大多数的比较研究都是使用这两家公司的产品【5】。截止目前应用MALDITOFMS可以鉴定几乎所有细菌，部分真菌和病毒等微生物。MALDI的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，常用的基质主要包括2,5二羟基苯甲酸（DHB）、氰基4羟基肉桂酸（CHCA）、3,5二甲氧基4羟基肉桂酸（SA）、甲酸（FA）等。基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程是将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程【1】。样品离子在加
10、速电场下获得相同动能，经高压加速聚焦后进入飞行时间检测器，5离子的质荷比（M/Z）与飞行时间的平方成正比，从而对样品进行分析【6】。理论上讲，只要飞行管的长度足够长，飞行时间检测器可以检测分子的质量数是无上限的，所以，基质辅助激光解析电离飞行时间很适合研究蛋白质、核酸等生物大分子。MALDITOFMS鉴定微生物主要原理是通过检测获得微生物的蛋白质图谱，并将所得的图谱与数据库中的微生物参考图谱比对后得出鉴定结果【7】。蛋白质图谱是由检测器将接受、检测和记录的质量分离器分离的离子后求出M/Z值，以M/Z为横坐标，离子的相对强度为纵坐标给出M/Z的分析图谱，不同的物质有不同的质量谱【8】。目前，MA
11、LDITOF质谱作为一种快速准确的检测技术，已广泛用于微生物的鉴定和分类。1材料与方法11主要标本广东省某三甲医院微生物室接收的来自不同临床科室用于细菌真菌培养鉴定的临床标本，标本类型包括血液，脑脊液，胸腹水，引流液，胆汁，尿液，痰，伤口分泌物，鼻咽拭子，粪便，阴道分泌物。12主要试剂和培养基（1）哥伦比亚血琼脂培养基，沙保氏葡萄糖琼脂培养基，沙门菌志贺菌SS琼脂培养基，麦康凯琼脂培养基，含复合维生素X的巧克力琼脂培养基，淋病瑟氏菌及肠膜奈瑟菌巧克力琼脂培养基，均购自生物XXX公司；营养肉汤培养基，购自XX抚生实业有限公司；（2）氰基4羟基肉桂酸（CHCA），甲酸（FA），均购自生物XXX公司
12、；（3）基因组小量提取试剂盒，购自美国AXYGEN公司；TAQ酶及PCR相关试剂，购自日本TAKARA公司。（4）VITEK2COMPACT鉴定试卡，购自生物XXX公司。13主要仪器MOLDITOFMS质谱仪，法国生物XXX公司；电热恒温培养箱，中国XX新苗医疗器械制造有限公司；VITEK2COMPACT全自动微生物分析系统，法国生物XXX公司；VITEK2DENSICHEKPLUS比浊仪，法国生物XXX公司；6NU44044E生物安全柜，美国NUAIRE公司；PCR仪，德国BIOMETRA公司14病原菌培养室温下，在生物安全柜中操作，将接收到的标本接种到相应的培养基上。然后将培养基放到37恒
13、温孵育箱中孵育1824H，其中单独将沙保氏葡萄糖琼脂培养基放到28恒温孵育箱中孵育2472H。不同的细菌真菌根据培养特性确定时间，当平板上出现很好的单菌落时进行上机操作。不同类型标本接种培养基情况如下（“”代表接种此培养基）15样品处理（1）对于细菌，棉签挑取适量可疑致病菌单菌落，于一次性悬浮管中用045的无菌盐水调制成05062麦氏浓度的菌悬液；用同样方法将真菌菌调制成1822麦氏浊度的菌悬液。选择合适的VITEK2COMPACT鉴定卡进行上机。（2）用一次性1L接种环挑可疑取单菌落适量菌量涂在一次性靶板上，对于细菌直接再滴加1L平板类型哥伦比亚血琼脂培养基沙保氏葡萄糖琼脂培养基含复合维生素
14、X的巧克力琼脂培养基麦康凯琼脂培养基沙门菌志贺菌SS琼脂培养基淋病瑟氏菌及肠膜奈瑟菌巧克力琼脂培养基营养肉汤培养基报阳血瓶脑脊液胸腹水胆汁引流液尿液痰伤口分泌物鼻咽拭子粪便阴道分泌物7CHCA，自然晾干。对于真菌先滴加05LFA，自然晾干后再加1LCHCA，室温下自然晾干。将靶板放入仪器中，进行质谱检测。2结果处理（1）对于两种方法鉴定结果不一致的菌株进行16SRDNA测序（2）对于VITEK2COMPACT鉴定率小于90和MADITOFMS鉴定结果为低分辨率鉴定和无鉴定结果的菌株进行16SRDNA测序。表1MALDITOF和VITEK2COMPACT结果一致的病原菌菌名数量鲍曼不动杆菌复合群
15、30杰氏棒状杆菌1布氏柠檬酸杆菌2弗劳地柠檬酸杆菌6克氏柠檬酸杆菌1大肠埃希菌297产气肠杆菌13铅黄肠球菌2粪肠球菌10屎肠球菌24鹑鸡肠球菌1小肠肠球菌3产酸克雷伯菌10肺炎克雷伯菌66微球菌属3摩根摩根菌7铜绿假单胞菌126恶臭假单胞菌1嗜麦芽窄食单胞菌338奇异变形杆菌75普通/彭氏变形杆菌9雷氏普罗威登斯菌2金黄色葡萄球菌76表皮葡萄球菌36人葡萄球菌人亚种37腐生葡萄球菌1溶血葡萄球菌14科氏葡萄球菌科氏亚种1头状葡萄球菌5粘质沙雷菌23副血链球菌1肺炎链球菌4缓症链球菌/口腔链球菌3解没食子链球菌1戈登链球菌1唾液链球菌1无乳链球菌5血链球菌1海藻希瓦菌3副溶血弧菌1近平滑假丝酵
16、母2产吲哚金黄杆菌1啮蚀艾肯菌1沙门菌群2单核细胞增生李斯特菌1流感嗜血杆菌1洋葱伯克霍尔德菌1总计9489表2MALDITOF与VITEK2COMPACT结果不一致的病原菌基因测序结果菌株数MALTOFMSVITEK2COMPACT属水平鉴定错误种水平鉴定错误属水平鉴定错误种水平鉴定错误鲍曼不动杆菌22约氏不动杆菌22弗氏枸橼酸杆菌11阴沟肠杆菌464646屎肠球菌11恶臭假单胞菌11铜绿假单胞菌11人葡萄球菌44金黄色葡萄球菌413表皮葡萄球菌11无乳链球菌22缓症链球菌333近平滑念珠菌11粘质红酵母111氧化木糖无色杆菌33产吲哚金黄杆菌111产单核细胞李斯特菌11新型隐球菌11总计7
17、60（0）57556605964625在分离到的1024株细菌中，用MALDITOFMS的方法，将1024100株病原菌鉴定到属的水平，将9679443株细菌鉴定到种的水平。用MALDITOFMS和常规VITEK2COMPACT的方法有9489258株病原菌鉴定结果完全一致（参见表1）。还有76株病原菌两种鉴定方法存在差异，以16SDNA为标准，发现MALDITOFMS鉴定病原菌在属的水平没有出现错误鉴定的结果，但是当鉴定到种的水平，有556的错误鉴定率。（参见表2）103讨论对于诊断感染性疾病的病因，病原菌的培养、分离和鉴定仍然是金标准。但是对于一些苛养菌、生长缓慢菌和真菌等，对培养环境要求
18、高、生长周期长，得到病原菌诊断需要花费很长时间【9】。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术是基于蛋白组学发展起来的快速鉴定技术，已经在临床微生物室得到了越来越多的应用。通过此次研究发现，应用VITEKMSMALDITOF系统可以鉴定绝大多数常规的临床微生物。鉴定准确率高，可以将所有的病原菌正确鉴定到属的水平，直接准确鉴定到种的水平的菌株占到了9443，与常规的鉴定方法，即VITEK2COMPACT相比，准确率有了相应的提高VITEK2COMPACT鉴定病原菌到属的准确率为9941，直接鉴定到种的准确率为9375。近期SENG等人的研究表明MALDITOFMS可以取代传统的微生物鉴定系统【10】
19、。在其研究中大于95的临床菌株被正确鉴定到种的水平。一些研究也表明，VITEKMS鉴定系统不能正确区分阴沟肠杆菌和阿氏肠杆菌，但是常规的鉴定系统不会出现这种情况，类似的，VITEKMS也不能正确区分嗜水气单胞菌和豚水气单胞菌【11】。造成这种现象的原因是难以区分的两种菌的蛋白质图谱太过相近，这也表明VITEKMS的数据库还有待完善和升级。MALDITOFMS可以快速的鉴定阳性球菌，包括葡萄球菌、肠球菌、链球菌。凝固酶阴性的葡萄球菌是常见的血培养分离菌，大约占血培养分离菌的45，然而6080从血培养中分离到的凝固酶阴性葡萄球菌是污染菌，随着侵入性外科手术的增加，大约2738的导管相关性血流感染是
20、由凝固酶阴性的葡萄球菌引起的【12】。因此从葡萄球菌引起的血流感染中快速准确的鉴定到种的水平是非常重要的。在过去的十年，真菌感染率逐年上升，尤其是血清芽管实验阴性的真菌。真菌的耐药性也在不断变化，快速准确的真菌鉴定是临床迫切需要的。而基于DNA测序的分子生物学方法，如16S或18SRDNA或ITSDNA测序和实时PCR的方法成本高，花费时间长，不能满足临床的需求。LOHMANN等人收集了312株临床真菌菌株用MALDITOFMS进行鉴定，发现这是一种快速而可靠的鉴定真菌的方法【13】。在他的研究中和此次试验均认为，真菌的鉴定错误是由于数据库的不完善。总而言之，在常规实验室诊断感染型疾病中，MA
21、LDITOFMS技术是一种非常有用的工具。但是对于这种方法存在的局限性，我们也应该清醒的认识到。首先，它暂时还无法区分志贺菌和大肠埃希菌，当来自粪便标本中的病原菌鉴定为大肠埃希菌时，需要附加试验进行确认【14】。其次，仍然需要一些生化和血清学方法来正确对沙门菌属进行区分，尤其是从其他的沙门血清型区分出伤寒沙门菌【15】。11通过此次试验，我发现影响MALDITOFMS鉴定结果质量的因素主要有菌的纯度、涂在靶板上菌的数量以及操作者的经验。在进行操作之间，操作者需要进行一系列的培训，才能更好的掌握操作技巧，以保证仪器可以得到良好的鉴定结果。在涂靶板的过程中要特别注意靠近校准点的孔位容易混合进校准点
22、所涂的大肠埃希菌的标准均准ATCC8739，因为孔位之间的距离非常近，操作者应该提高警惕【16】。4结论综上，MALDITOFMS与传统的表型鉴定相比用更短的时间和更低的成本可以给出相同甚至更好的鉴定准确率，此次试验也表明，在常规的临床微生物实验室，VITEKMS有取代传统鉴定系统的潜能。当然，数据库仍需要不断完善以进一步提高病原菌鉴定的准确率。未来，VITEKMS将在实验室得到更普遍的应用。12参考文献【1】刘新海基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱用于直接鉴定临床病理样本中微生物的研究【J】检验医学与临床，2012,9（14）17421744【2】WEPINGWANG，HAIYANXI，MEI
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28、TEDLASERDESORPTIONIONIZATIONTIMEOFFLIGHTMASSSPECTROMETRYFOLLOWINGINTRODUCTIONFORROUTINELABORATORYBACTERIALIDENTIFICATIONJJCLINMICROBIOL20114929804【15】RYZHOVV,HATHOUTY,FENSELAUCRAPIDCHARACTERIZATIONOFSPORESOFBACILLUSCEREUSGROUPBACTERIABYMATRIXASSISTEDLASERDESORPTIONIONIZATIONTIMEOFFLIGHTMASSSPECTROME
29、TRYJAPPLENVIRONMICROBIOL200066382834【16】BIZZINIA,DURUSSELC,BILLEJ,ETALPERFORMANCEOFMATRIXASSISTEDLASERDESORPTIONIONIZATIONTIMEOFFLIGHTMASSSPECTROMETRYFORIDENTIFICATIONOFBACTERIALSTRAINSROUTINELYISOLATEDINACLINICALMICROBIOLOGYLABORATORYJJCLINMICROBIOL20104815495414重庆医科大学检验医学院本科学生毕业论文开题报告学生姓名学号2011222
30、665年级与班级11级生物技术指导教师姓名职称大客户经理/讲师所在单位XXX诊断产品（XX）有限公司毕业论文题目MALDITOFMS对临床分离病原菌的鉴定评估选题意义目前临床医生迫切需要对感染性疾病做出准确及时的病因学诊断，以及时用药挽救病人的生命。而MALDITOFMS的出现正好满足了临床的需求，那么这种快速鉴定的方法究竟准确率如何，是不是真的可以为临床医生及患者带来希望，本次研究就是来解答这些问题。研究内容收集临床常规分离株，用MALDITOFMS对病原菌进行快速鉴定，比较这种快速鉴定的方法与常规鉴定的符合率以及其准确率。进度与时间安排2015年13月查阅文献资料，选题2015年34月完成
31、初稿，接受中期检查2015年5月修改论文定稿指导教师对开题报告的审核意见选题比较新颖，紧跟微生物室发展趋势，具有研究价值，对临床有一定的指导意义，同意此论文题目。指导教师签名2015年5月14日领导小组对开题报告的审核意见组长签名年月日15致谢本论文是在XXX诊断产品（XX）有限公司大客户经理老师的悉心指导下完成的，张老师作为产品经理，平时工作特别繁忙，但是她还是在百忙之中，对我进行了耐心的指导和帮助，不断引导我开阔思路，鼓励我大胆创新，为我答疑解惑，对此我深表谢意另外，要特别感谢中山大学附属第一医院微生物室的各位老师们，在一起工作学习的日子里，每个人都竭尽所能的提供给我帮助，从标本的处理到最后的数据统计，每个人都曾指点过我，使我在这个过程中不断进步。感谢你们毕业论文的准备过程中也得到了一些学长学姐的帮助，他们曾同我分享自己的经验，帮助我正确选题，对他们我也表示衷心的感谢四年的大学时光匆匆而逝，四年里我收获的不仅仅是专业知识和技能，更是一大批同学的友情，还有浓浓的师生情。感谢重庆医科大学检验医学院的每一位老师，是您们的谆谆教导成就了今天日趋完美的我，感谢我生命中出现的每一个人，谢谢大家带给我的启迪和成长我相信，以后走出美丽校园的我依旧可以活出自己的精彩，因为，我很幸运，拥有过完美的四年大学时光。感谢母校的培育，今天的我以母校为荣，未来，母校同样会以我为荣
