1、1兵团高中生物教师新课程实验技能培训讲义生命科学学院实验教学中心2012.012目 录实验一：生物学实验基本要求实验二：使用高倍显微镜观察叶绿体、线粒体的形态和分布实验三：果酒和果醋的制作实验四：制作泡菜并检测亚硝酸盐含量 实验五：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验六：菊花的组织培养实验七：植物芳香油的提取实验八：胡萝卜素的提取实验九：物理、化学因素诱导植物染色体数目变化实验十：观察 DNA 和 RNA 在细胞中分布实验十一：酵母细胞的固定化实验十二：DNA 的制备和鉴定实验十三：微生物的实验室培养实验十四：血红蛋白的提取和分离实验十五：果胶酶在果汁生产中的作用3实验一：生物学实验基本要求
2、一.生物化学实验室规则1.每个同学都应该自觉遵守课堂纪律,维护课堂秩序 ,不迟到,不早退, 不大声谈笑,2.实验前必须认真预习 ,熟悉本次实验的目的.原理.操作步骤, 懂得每一操作步骤的意义和了解所用仪器的使用方法,否则不能开始实验 ,实验过程中要严肃认真地按操作规程进行实验,并把实验结果和数据及时.如实记录在实验记录本上,文字简练.准确,要求同学们记录完整准确的实验数据,养成良好的实事求是的工作作风和求真务实的科学态度,严禁伪造实验数据,弄虚作假,3.实验台面应随时保持整洁,仪器.药品摆放整齐,公用试剂用毕, 应立即盖严放回原处,勿使试剂.药品洒在实验台面和地上,实验完毕, 仪器须洗净放好,
3、将实验台面抹试干净,才能离开实验室,4.使用仪器 .药品.试剂和各种物品必须注意节约,洗涤和使用仪器时, 应小心细致,防止损坏仪器,使用贵重精密仪器时,应严格遵守操作规程, 发现故障须立即报告教员,不得擅自动手检修,5.实验室内严禁吸烟！煤气灯应随用随关,严格做到 :人在火在,人走火灭, 乙醇.丙酮.乙醚等易燃品不能直接加热,并要远离火源操作和放置,实验完毕, 应立即关好煤气开关和水笼头,拉下电闸,离开实验室以前应认真.负责地进行检查, 严防发生安全事故,6.所有实验用的废液 ,废弃物等 ,都要收集在适当的容器内,加以储存再处理, 不能倒在水槽内或到处乱扔,7.仪器损坏时 ,应如实向教员报告
4、,并填写损坏仪器登记表,然后补领,8.实验室内一切物品 ,未经本室负责教员批准 ,严禁携出室外,借物必须办理登记手续,9.每次实验课由班长负责安排值日生,值日生的职责是负责当天实验室的卫生 .安全和一切服务性的工作及填写实验情况登记卡和实验记录,二.生物学实验室常用仪器使用方法与保养41.冷冻离心机低温分离技术是分子生物学研究中必不可少的手段,基因片段的分离. 酶蛋白的沉淀和回收以及其它生物样品的分离制备实验中,都离不开低温离心技术 ,因此低温冷冻离心机已成为分子生物学研究中必需的重要工具,使用方法:(1)离心机应放置在水平坚固的地板或平台上,并力求使机器处于水平位置以免离心时造成机器震动,(
5、2).打开电源开关,按要求装上所需的转头,将预先以托盘天平平衡好的样品放置于转头样品架上(离心筒须与样品同时平衡),关闭机盖,(3).按功能选择键,设置各项要求:温度.速度.时间.加速度及减速度 ,带电脑控制的机器还需按储存键,以便记忆输入的各项信息,(4).按启动键,离心机将执行上述参数进行运作,到预定时间自动关机,(5).待离心机完全停止转动后打开机盖,取出离心样品 ,用柔软干净的布擦净转头和机腔内壁,待离心机腔内温度与室温平衡后方可盖上机盖 ,注意事项:(1).机体应始终处于水平位置,外接电源系统的电压要匹配 ,并要求有良好的接地线,(2).开机前应检查转头安装是否牢固,机腔有无异物掉入
6、 ,(3).样品应预先平衡,使用离心筒离心时离心筒与样品应同时平衡 ,(4).挥发性或腐蚀性液体离心时,应使用带盖的离心管 ,并确保液体不外漏,以免腐蚀机腔或造成事故,(5).擦拭离心机腔时动作要轻,以免损坏机腔内温度感应器 ,(6).每次操作完毕应作好使用情况记录,并定期对机器各项性能进行检修 ,(7).离心过程中若发现异常现象,应立即关闭电源,报请有关技术人员检修,附:相对离心力与每分钟转速的换算离心机的转速,在以前实验资料中一般以每分钟多少转来表示 ,由于离心力不仅为转速函数,亦为离心半径的函数,即转速相同时,离心半径越长, 产生的离心力越大,因此仅以转速表达离心力是不够科学的,近年来主
7、张用相对离心力 (RCF)来表示比较合理,现在国际资料中,已改用相对离心力来表示,52.分光光度计不同物质对不同波长入射光的吸收程度各不相同,从而形成特征性的吸收光谱 ,分光光度法不仅适应于可见光区,同时还可扩展至紫外光区及红外光区 ,因此给科研实验带来了极大方便,下面重点介绍分光光度计的使用及注意事项 ,使用规则(1).接通稳压器电源,待稳压器输出电压稳定至 200V 后打开光度计电源, 仪器自动进入初始化,(2).初始化约需时 10min,内容包括:寻找零级光；建立基线；最后当显示器指示nm 时,表明仪器完成初始化程序,可进入检测状态,(3).按要求输入各项参数,选择相应比色杯(玻璃或石英
8、 ),将空白管. 标准管及待测管依次放入比色皿架内,关上比色池盖,(4).以空白管自动调零,(5).试样槽依次移至样品位置,待数据显示稳定后按 “START/STOP”键,打印机自动打印所测数据,重复上述步骤,直到所有样品检测完毕,(6).检测结束后应及时取出比色杯,并清洗干净放回原处 ,同时关上仪器电源开关及稳压器电源开关,做好使用情况登记,注意事项(1).仪器初次使用或使用较长时间(一般为一年),需检查波长准确度,以确保检测结果的可靠性,(2).由于长途运输或室内搬运可能造成光源位置偏移,导致亮电流漂移增大, 此时对光源位置进行调整,直至达到有关技术指标为止,若经调整校正后波长准确度.暗电
9、源漂移及亮电流漂移三项关键指标仍未符合要求,则应停止使用, 并及时通知有关技术人员检修,(3).每次检测结束后应检查比色池内有否溶液溢出,若有溢出应随时用滤纸吸干,以免引起测量误差或影响仪器使用寿命,(4).仪器每次使用完毕,应于灯室内放置数袋硅胶(或其它干燥剂 ),以免反射镜受潮霉变或沾污,影响仪器使用,同时盖好防尘罩,(5).仪器室应通常保持洁净干燥,室温以 5-35为宜,相对温度不得超过 85%,有条件者应于室内配备空调机及除湿机,以确保仪器性能稳定 ,6(6).仪器室不得存放酸.碱.挥发性或腐蚀性等物质,以免损坏仪器,(7).仪器长时间不用时,应定时通电预热,每周 1 次,每次 30m
10、in,以保证仪器处于良好使用状态3.电泳仪:电泳技术是生物化学与分子生物学研究不可缺少的重要分析手段,电泳一般分为自由界面电泳和区带电泳两大类,自由界面电泳不需支持物 ,如等电聚焦电泳.等速电泳.密度梯度电泳及显微电泳等,这类电泳目前已很少使用,而区带电泳则需用各种类型的物质作为支持物,常用的支持物有滤纸 .醋酸纤维薄膜.非凝胶性支持物.凝胶性支持物及硅胶-G 薄层等,分子生物学领域中最常用的是琼脂糖凝胶电泳,所谓电泳,是指带电粒子在电场中的运动,不同物质由于所带电荷及分子量的不同,因此在电场中运动速度不同,根据这一特征,应用电泳法便可以对不同物质进行定性或定量分析,或将一定混合物进行组份分析
11、或单个组份提取制备 ,这在临床检验或实验研究中具有极其重要的意义,电泳仪正是基于上述原理设计制造的,使用方法(1).首先用导线将电泳槽的两个电极与电泳仪的直流输出端联接,注意极性不要接反,(2).电泳仪电源开关调至关的位置,电压旋钮转到最小 ,根据工作需要选择稳压稳流方式及电压电流范围,(3).接通电源,缓缓旋转电压调节钮直到达到的所需电压为止 ,设定电泳终止时间,此时电泳即开始进行,(4).工作完毕后,应将各旋钮.开关旋至零位或关闭状态,并拨出电泳插头,注意事项(1).电泳仪通电进入工作状态后,禁止人体接触电极 .电泳物及其它可能带电部分,也不能到电泳槽内取放东西,如需要应先断电,以免触电,
12、同时要求仪器必须有良好接地端,以防漏电,(2).仪器通电后,不要临时增加或拨除输出导线插头 ,以防短路现象发生,虽然仪器内部附设有保险丝,但短路现象仍有可能导致仪器损坏 ,(3).由于不同介质支持物的电阻值不同,电泳时所通过的电流量也不同 ,其泳动速7度及泳至终点所需时间也不同,故不同介质支持物的电泳不要同时在同一电泳仪上进行,(4).在总电流不超过仪器额定电流时(最大电流范围),可以多槽关联使用,但要注意不能超载,否则容易影响仪器寿命,(5).某些特殊情况下需检查仪器电泳输入情况时,允许在稳压状态下空载开机 ,但在稳流状态下必须先接好负载再开机,否则电压表指针将大幅度跳动 ,容易造成不必要的
13、人为机器损坏,(6).使用过程中发现异常现象,如较大噪音.放电或异常气味,须立即切断电源, 进行检修,以免发生意外事故,4.分析天平:分析天平是定量分析工作中不可缺少的重要仪器,充分了解仪器性能及熟练掌握其使用方法,是获得可靠分析结果的保证,分析天平的种类很多,有普通分析天平.半自动/全自动加码电光投影阻尼分析天平及电子分析天平等 ,操作方法(1).检查并调整天平至水平位置,(2).事先检查电源电压是否匹配(必要时配置稳压器),按仪器要求通电预热至所需时间,(3).预热足够时间后打开天平开关,天平则自动进行灵敏度及零点调节 ,待稳定标志显示后,可进行正式称量,(4).称量时将洁净称量瓶或称量纸
14、置于称盘上,关上侧门 ,轻按一下去皮键,天平将自动校对零点,然后逐渐加入待称物质,直到所需重量为止,(5).被称物质的重量是显示屏左下角出现“”标志时, 显示屏所显示的实际数值,(6).称量结束应及时除去称量瓶(纸),关上侧门,切断电源, 并做好使用情况登记,注意事项(1).天平应放置在牢固平稳水泥台或木台上,室内要求清洁 .干燥及较恒定的温度,同时应避免光线直接照射到天平上,(2).称量时应从侧门取放物质,读数时应关闭箱门以免空气流动引起天平摆动 ,前门仅在检修或清除残留物质时使用,(3).电子分析天平若长时间不使用,则应定时通电预热 ,每周一次,每次预热 2h,以8确保仪器始终处于良好使用
15、状态,(4).天平箱内应放置吸潮剂(如硅胶),当吸潮剂吸水变色,应立即高温烘烤更换, 以确保吸湿性能,(5).挥发性.腐蚀性.强酸强碱类物质应盛于带盖称量瓶内称量,防止腐蚀天平,实验二：使用高倍显微镜观察叶绿体、线粒体的形态和分布一 、实验目的1使用高倍显微镜观察叶绿体和线粒体的形态和分布。2识别光学显微镜下的叶绿体和线粒体。二 、实验原理地球上绝大多数生命活动所需能量的最终源头是太阳能，绿色植物是主要的能量转换者，完成这一能量转换的细胞器是叶绿体。叶绿体利用光能将二氧化碳和水合成糖类等有机物，同时产生氧。在高等植物细胞中叶绿体呈椭球形，长径 510 m，短径 24 m，厚 23 m。高等植物
16、的叶肉细胞中一般含50200 个叶绿体，可占细胞质的 40%。叶绿体的数目因同种植物不同细胞类型、生态环境、生理状态而有所不同。在藻类细胞中，叶绿体形状多样，有网状、带状、裂片状和星形等，而且体积巨大，长径可达 100 m。线粒体普遍存在于植物细胞和动物细胞中，线粒体的形态多样，有短棒状、圆球状、线形、哑铃形等。线粒体是细胞进行有氧呼吸的主要场所，内含细胞色素氧化酶系。健那绿是一种碱性染料,可以专一性地对线粒体进行染色。与线粒体内的细胞色素氧化酶系发生作用时，染料始终保持氧化状态,呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中的染料被还原为无色的状态，线粒体能在健那绿染液中维持活性数小时，通过染色可以在高倍
17、显微镜下观察到呈现蓝绿色的线粒体的形态和分布。9三 、试剂与仪器1、材料：新鲜的藓类的叶（或菠菜叶、黑藻叶等） ，人的口腔上皮细胞，洋葱内表皮，幼苗或幼根。2、器具：数码显微镜，载玻片，盖玻片，滴管，吸水纸，镊子，消毒牙签。3、试剂的配制（1） 0.5g 詹姆斯绿溶解于 50ml 生理盐水中1%詹姆斯绿染液（2） 配制 0.9%的生理盐水 200ml。称取 1g 詹姆斯绿，溶于 50ml 生理盐水中，再用生理盐水稀释 100 倍，得 0.02%詹姆斯绿染液装入棕色瓶备用。 （3）0.05g 詹姆斯绿溶解于 5ml Ringer 液。Ringer 液（复合生理盐水）：0.25g kcl+0.85
18、gNacl+0.03gCacl 加入 100ml 水）注意事项：詹姆斯绿染液浓度不宜过高，染色时间不宜太长，否则细胞质会重新氧化成有色状态而不能充分还原染料成无色状态。配制时间：詹姆斯绿染液宜在使用时配制新鲜液，不可久存。四 、方法与步骤1、选材的原则： 选用的实验材料既要容易获得，又要便于观察；观察叶绿体时选用：藓类的叶、黑藻的叶。取这些材料的原因是：叶子薄而小，叶绿体清楚，可取整个小叶直接制片，所以作为实验的首选材料。若用菠菜叶作实验材料，要取菠菜叶的下表皮并稍带些叶肉。洋葱鳞片叶表皮细胞(为避免原有颜色的干扰，不可使用紫色表皮细胞)取口腔上皮细胞之前，应先漱口，以避免装片中出现太多的杂质
19、；取洋葱表皮细胞时，尽量避免材料上带有叶肉组织细胞2、制作鲜类叶片临时装片10在洁净的载玻片中央滴一滴清水。用镊子取一片藓类的小叶，或者取菠菜叶稍带些叶肉的下表皮，放入水滴中，盖上盖玻片。注意：临时装片中的叶片不能放干了，要随时保持有水状态。 3、观察叶绿体将制作好的叶片临时装片放在低倍显微镜下观察，找到叶片细胞后，换用高倍镜，仔细观察叶片细胞内叶绿体的形态和分布情况。 4、制作人的口腔上皮细胞临时装片(1)把清洁的载玻片平放在桌上，滴上数滴詹姆斯绿染液于载玻片中央。(2)用消毒牙签的钝端在自己口腔颊粘膜处稍用力刮取口腔上皮细胞，均匀地涂到载玻片的染液中。盖上盖玻片，四周溢出的染液用吸水纸吸干。 (3)5 分钟后用高倍镜或油镜观察，可以看到在接近无色的口腔上皮细胞的细胞质中，特别是在细胞核周围，散布着许多被染成蓝绿色的短棒状或颗粒状结构，即为线粒体。5、观察洋葱鳞茎表皮细胞线粒体(1)撕取 55 毫米一块新鲜洋葱鳞茎内表皮，展平在洁净载玻片中央。(2)滴上数滴詹姆斯绿染液染色 10 分钟，盖上盖玻片，用吸水纸吸去周围溢出的染液。(3)在高倍镜或油镜下可以观察到细胞质中的线粒体被染成蓝绿色，呈条状或颗粒状。6、观察线粒体在高倍镜下观察经过染色的人的口腔上皮细胞临时装片，可以看到蓝绿色的线粒体，细胞质接近无色。 五、实验报告1、显微镜下绘出叶绿体、线粒体的图
