1、GB/T22388-2008原料乳与乳制品中三聚氛胺检测方法2008-10-07 发布2008-10-07 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会发布前言本标准包括三个方法:第一法高效液相色谱法,第二法液相色谱一质谱/质谱法, 第三法气相色谱一质谱联用法,检测时, 应根据检测对象及其限量的规定,选用与其相适应的检测方法, 本标准的附录氰为资科性開录,本标准由全国食品安全应急标准化工作组、全国质量监管重点产品检验方法标准化技术委员会提出并归口,本标准第一法起草单位:中国检验检疫科学研究院、中国疾病预防控制中心、国家食品质量安全监督检验中心、北京市疾病预防控制中心、国家
2、乳制品质量监督检验中心、渐江省质量技术监管检演研究院、国家加工食品质量监督检验中心(广州),本标准第一法主要起草人:宋书锋、鲁杰、安娟、杨大进、李淑娟、张晶、刘艳琴、杨红梅、杨金宝、鄂来明、廖上富、陈小珍、蔡依军、郭新东、吴玉空,本标准第二法起草单位:中国检验检疫科学研究院、北京市疾病预防控制中心、国家食品质量安全监督检验中心、中国疾病预防控制中心、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局,本标准第二法主要起草人:彭涛、吴永宁、邵兵、王浩、李晓娟、郭启雷、苗虹、赵云峰、丁涛、李立、蒋原,本标准第三法起草单位:上海市质量监督检验技术研究院、国家食品质量安全监督检验中心、中国检验检疫科学研究院,本标准第
3、三法主要起草人:巢强国、常宇文、雷涛、陈冬东、赵玉琪、周通斌、種同娜、葛宇、曹程明、张辉、麦成华、曹红,原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法1. 范围本标准規定了原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的三种测定方法,即高效液相色谱法(HPLC 法)、液相色谱一质谱/质谱法(LC-MS/MS 法)和气相色谱一质谱联用法包括气相色谱一质谱法(GC-MS 法),气相色谱一质谱/质谱法(GC-MS/MS 法)。本标准适用于原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的定量测定;液相色谱一质谱/质谱法、气相色谱一质谱联用法(包括气相色谱一质谱/质谱法)同时适用于原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的定性确证。本标准高
4、效液相色谱法的定量限为 2 mg/kg,液相色谱一质谱/质谱法的定量限为 0.01 mg/kg,气相色谱一质谱法的定量限为 0.05 mg/kg(其中气相色谱一质谱/质谱法的定量限为0.005 mg/kg)。2. 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682-2008,IS03696:1987,M0D)第二法液
5、相色谱质谱/质谱法(LCMS/MS 法)2.1. 原理试样用三氯乙酸溶液提取,经阳离子交换固相萃取柱净化后,用液相色谱质谱/质谱法测定和确证，外标法定量。2.2. 试剂与材料除非另有说明,所有试剂均为分析纯,水为 GB/T6682 规定的一级水。2.2.1. 乙酸。2.2.2. 乙酸铵。2.2.3. 乙酸铵溶液(10mmol/L)：准确称取 0.772g 乙酸铵于 1L 容量瓶中,用水溶解并定容至刻度，混匀后备用。2.2.4. 甲醇:色谱纯。2.2.5. 乙腈:色谱纯。2.2.6. 氨水：含量为 25%28%。2.2.7. 三氯乙酸。2.2.8. 柠檬酸。2.2.9. 辛烷磺酸钠：色谱纯。2.
6、2.10. 甲醇水溶液：准确量取 50 mL 甲醇和 50 mL 水,，混匀后备用。2.2.11. 三氯乙酸溶液(1%)：准确称取 10g 三氯乙酸于 1 L 容量瓶中,用水溶解并定容至刻度,混匀后备用。2.2.12. 氨化甲醇溶液(5%):准确量取 5 mL 氨水和 95 mL 甲醇，混匀后备用。2.2.13. 离子对试剂缓冲液:准确称取 2.10 g 柠檬酸和 2.16 g 辛烷磺酸钠,加人约 980 mL水溶解,调节 pH 至 3.0 后,定容至 1 L 备用。2.2.14. 三聚氰胺标准品:CAS108-78-01,纯度大于 99.0%。2.2.15. 三聚氰胺标准储备液:准确称取 1
7、00mg(精确到 0.1 mg)三聚氰胺标准品于 100mL 容量瓶中,用甲醇水溶液(3.2.7)溶解并定容至刻度,配制成浓度为 1 mg/mL 的标准储备液,于 4避光保存。2.2.16. 阳离子交换固相萃取柱:混合型阳离子交换固相萃取柱,基质为苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物,填料质量为 60mg,体积为 3mnL,或相当者。使用前依次用3mL 甲醇、5mL 水活化。2.2.17. 定性滤纸。2.2.18. 海砂:化学纯,粒度 0.65mm0.85mm,二氧化硅(S02)含量为 99%。2.2.19. 微孔滤膜:0.2Hm,有机相。2.2.20. 氮气:纯度大于等于 99.999%。2
8、.3. 仪器设备2.3.1. 液相色谱-质谱/质谱（LC-MS/MS）仪：配有电喷雾离子源（ESI） 。2.3.2. 分析天平:感量为 0.0001g 和 0.01g。2.3.3. 离心机:转速不低于 4000r/min。2.3.4. 超声波水浴。2.3.5. 固相萃取装置。2.3.6. 氮气吹干仪。2.3.7. 涡旋混合器。2.3.8. 具塞塑料离心管:50mL2.3.9. 研钵。2.4. 样品处理2.4.1. 提取2.4.1.1.液态奶、奶粉、酸奶冰淇淋和奶糖等称取 1g(精确至 0.01g)试样于 50mL 具塞塑料离心管中,加人 8mL 三氯乙酸溶液(2.2.11)和2mL 乙腈,超声
9、提取 10min,再振荡提取 10min 后,以不低于 4000r/min 离心 10min。上清液经三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后,做待净化液。2.4.1.2.奶酪、奶油和巧克力等称取 1g(精确至 0.01g)试样于研钵中,加人适量海砂(试样质量的 4 倍6 倍)研磨成干粉状,转移至 50mL 具塞塑料离心管中,加入 8mL 三氯乙酸溶液(2.2.11）分数次清洗研钵,清洗液转入离心管中,再加入 2mL 乙腈,余下操作同 2.4.1.1 中“超声提取 10min,做待净化液” 。注:若样品中脂肪含量较高,可以用三氯乙酸溶液饱和的正己烷液液分配除脂后再用SPE 柱净化。2.4.1.3.净化将
10、2.4.1 中的待净化液转移至固相萃取柱(3.2.13)中。依次用 3mL 水和 3mL 甲醇洗涤抽至近干后,用 6mL 氨化甲醇溶液洗脱。整个固相萃取过程流速不超过 1mL/min。洗脱液于50下用氮气吹干,残留物(相当于 1g 试样)用 1mL 流动相定容,涡旋混合 1min,过微孔滤膜后,供 LC-MS/MS 测定。2.5. 液相色谱质谱/质谱测定2.5.1. LC 参考条件2.5.1.1.色谱柱:强阳离子交换与反相 C18 混合填料,混合比例(1:4),150mm2.0mm内径(i.d.)2.5.1.2.流动相:等体积的乙酸铵溶液和乙腈充分混合,用乙酸调节至 pH=3.0 后备用。2.
11、5.1.3.进样量:10L2.5.1.4.柱温:40。2.5.1.5.流速:0.2mL/min2.5.2. MS/MS 参考条件2.5.2.1.电离方式:电喷雾电离,正离子。2.5.2.2.离子喷雾电压:4kV。2.5.2.3.雾化气:氮气,2.815kg/cm2(40psi)。2.5.2.4.干燥气:氮气,流速 10L/min,温度 350。2.5.2.5.碰撞气:氮气。2.5.2.6.分辨率:Q1(单位)Q3(单位)2.5.2.7.扫描模式:多反应监测(MRM),母离子 m/z127,定量子离子 m/z85,定性子离子 m/z682.5.2.8.停留时间:0.3s。2.5.2.9.裂解电压
12、:100V。2.5.2.10. 碰撞能量:m/z12785 为 20V,m/z12768 为 35V。2.5.3. 标准曲线的绘制取空白样品按照 4.4 处理。用所得的样品溶液将三聚氰胺标准储备液(3.2.12)逐级稀释得到的浓度为 0.01、0.05、0.1、0.2、0.5ug/mL 的标准工作液浓度由低到高进样检测,以定量子离子峰面积浓度作图,得到标准曲线回归方程。基质匹配加标三聚氰胺的样品 LC-MS/MS 多反应监测质量色谱图参见附录 A 中的图 A.2。2.5.4. 定量测定待测样液中三聚氰胺的响应值应在标准曲线线性范围内,超过线性范围则应稀释后再进样分析。2.5.5. 定性判定按照
13、上述条件测定试样和标准工作溶液,如果试样中的质量色谱峰保留时间与标准工作溶液一致(变化范围在士 2.5%之内);样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度一致,相对丰度偏差不超过表 1 的规定,则可判断样品中存在三聚氰胺。表 1 定性离子相对丰度的最大允许偏差相对离子丰度 50% 20%至 50% 10%至 20% 10允许的相对偏差 20% 25% 30% 50%2.5.6. 结果计算试样中三聚氰胺的含量由色谱数据处理软件或按式(1)计算获得: fAVX10mcs式中:X试样中三聚氰胺的含量,单位为毫克每千克(mg/kg);A样液中三聚氰胺的峰面积c-标准溶液中三聚氰胺的浓度,单位为微克每毫升(g/mL);V-样液最终定容体积,单位为毫升(mL);As-标准溶液中三聚氰胺的峰面积;M-试样的质量,单位为克(g);f稀释倍数。2.6. 空白实验除不称取样品外,均按上述测定条件和步骤进行。2.7. 方法定量限本方法的定量限为 0.01g/kg2.8. 回收率在添加浓度 0.01mng/kg0.5mg/kg 浓度范围内,回收率在 80%110%之间,相对标准偏差小于 10%。2.9. 允许差在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 15%。
