1、酶动力学综合实验实验（一）碱性磷酸酶 Km 值的测定【目的要求】1.了解底物浓度对酶促反应速度的影响2.了解米氏方程、Km 值的物理意义及双倒数作图求 Km 值的方法。【实验原理】1、碱性磷酸酶：碱性磷酸酶是广泛分布于人体各脏器器官中，其中以肝脏为最多。其次为肾脏、骨骼、肠和胎盘等组织。但它不是单一的酶，而是一组同功酶。本实验用的碱性磷酸酶是从大肠杆菌中提取的。2、米氏方程：Michaelis-Menten 在研究底物浓度与酶促反应速度的定量关系时，导出了酶促反应动力学的基本公式，即：(1)式中：v 表示酶促反应速度，表示酶促反应最大速度，S表示底物浓度，表示米氏常数。3、 值的测定主要采用图
2、解法，有以下四种：双曲线作图法（图 1-1，a）根据公式（1） ，以 v 对s作图，此时 1/2 时的底物浓度s值即为 Km 值，以克分子浓度（M）表示。这种方法实际上很少采用，因为在实验条件下的底物浓度很难使酶达到饱和。实测 一个近似值，因而 1/2 不精确。此外由于 v 对S的关系呈双曲线，实验数据要求较多，且不易绘制。 Lineweaver- Burk 作图法双倒数作图法（图 1-1，b）实际工作中，常将米氏方程（式（1） ）作数学变换，使之成为直线形式，测定要方便、精确得多。其中之一即取（1）式的倒数，变换为 Lineweaver- Burk 方程式：(2)以 对 作图，即为 y=ax
3、+b 形式。此时斜率为 ，纵截距为 。把直线外推与横轴相交，其截距相交，其截距即为 。Hofstee 作图法（略）把（2）式等号两边乘以 ，得：(3)以 v 对 作图，这时斜率为 ，纵截距为 ，横截距为 。Hanas 作图法（略）把（2）式等号两边乘以S,得：(4)以 对s作图，这时斜率为 ，纵截距为 。（a） (b)本实验主要以双倒数法，即 Lineweaver- Burk 作图法来测定碱性磷酸酶 Km 值。具体原理如下：本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其作用物，碱性磷酸酶能分解磷酸苯二钠产生酚和磷酸，在适宜条件下（PH10.0，和 60） ，准确反应 13 分钟。在碱性条件下酚可与酚
4、试剂生成蓝色化合物，以波长 620nm 比色。在一定条件下色泽深浅与光密度成正比。反应式如下：然后以光密度直接表示不同底物浓度时的酶反应速度，即以光密度的倒数作纵坐标，以底物浓度的倒数作横坐标，按 Lineweaver- Burk 作图法来测定碱性磷酸酶 Km 值。【仪器与试剂】仪器：1. 恒温水浴2. 721 型分光光度计试剂：1 酚试剂：称钨酸钠（ W 2 O）100g，钼酸钠（ Mo 2 O）25g 置 1500mL 磨口回流装置内，加蒸馏水 700mL，85%磷酸 50mL 和浓硫酸100mL。充分混匀，使其溶解。小火加热，回流 10h（烧瓶内加小玻璃珠数颗，以防溶液溢出） ，再加入硫
5、酸锂（LiSO4）150g，蒸馏水 50mL 及液溴数滴。在通风橱中开口煮沸 15min，以除去多余的溴。冷却后定容至1000mL，过滤即成，此液应为鲜黄色，不带任何绿色。置棕瓶中，可在冰箱长期保存。若此贮存液使用过久，颜色由黄变绿，可加几滴液溴，煮沸几分钟，恢复原色仍可继续使用。使用时用蒸馏水稀释一倍，最后酸度为1N。2 2.5mM 磷酸苯二钠基质液：称取 625mg 磷酸苯二钠（ C6H5PO4Na22H2O） ，溶于 1,000ml 容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，加数滴夜溴以防腐，置冰箱内可保存一年之久。3 碱性缓冲液（pH10.0）： 称取无水碳酸钠 6.36g 及碳酸氢钠 3.36g
6、，溶解于蒸馏水中，并稀释至 1,000ml.4 碱性磷酸酶液：称取碱性磷酸酶 1mg,加水 34ml，冰箱内可保存五周左右。【实验步骤】取 6 支试管按下表加入试剂：1 2 3 4 5 62.5mM 磷酸苯 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.0二钠（ml）蒸馏水（ml） 0.8 0.6 0.4 0.2 - 0.1碱性缓冲液（ml）1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0混匀后，60欲温 5 分钟碱性磷酸酶液（ml）0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 -混匀后，60水浴 13 分钟（准确计时）注意：1）加入碱性磷酸酶液要快速、准确。用移液枪加2）此时为酶促反应，总体积 2.1
7、ml3）第六管不加酶。酚试剂（ml） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.010%Na2CO3(ml)3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0混匀后，室温放置 15 分钟注意：1）酚试剂为显色剂，同时为酶的变性剂，故加入酚试剂后酶促反应即停止。2）Na2CO3 提供碱性环境，加入 Na2CO3 后试剂才显色以 6 管为调零点，在 620nm 波长处比色。【结果处理】1 将各管光密度和底物浓度记入下表管号 O.D 1/O.D S 1/S123452 以 1/O.D 为纵坐标，1/s为横坐标，按 Lineweaver- Burk 作图，求出碱性磷酸酶的 Km 值。【注意事项】1） 加
8、入碱性磷酸酶的量要准确2） 保温时间要准确准确保温的方法：从第一管加入酶液开始计时，每隔 1 分钟向下一只试管加酶液, 直至加完，到准确 13 分钟立即向第一管加酚试剂，以终止其反应，并每隔1 分钟向下一只试管加酚试剂,直至加完止，这样保证每管准确保温 13 分钟。【思考题】1） Km 的意义及其影响因子2） 为什么酶促反应速度以初速度表示3） 为什么 O.D 可直接代替 V 作图4） 分析自己的实验数据实验（二）温度对酶活性的影响【实验目的】了解温度对酶活性及酶促反应速度的影响，加深对酶特性的认识。【实验原理】每种酶都有其最适温度，高于或低于此温度酶的活性都降低。一般而言，若酶处于过高的温度
9、环境中，会使酶活性永久丧失；而若处于极低温度的环境中只会使酶活性受到抑制，一旦温度适宜，酶又会全部或部分的恢复其活性。【仪器与试剂】仪器：1冰箱 2.恒温水浴锅 3.试管和试管架4吸量管及吸量管架 5.移液枪及枪头 6.胶头滴管7烧杯试剂：1PH6.8 的缓冲液：量取 15.45ml 的 0.2M 磷酸氢二钠和 4.55ml 的柠檬酸混合摇匀即可。20.5%淀粉的 0.5%氯化钠溶液： 0.5g 可溶性淀粉和 0.5g 氯化钠，溶于100ml 蒸馏水（需加热） 。3003175g/L 碘液41M HCl 溶液 5.1M NaOH 溶液 6.稀释 100 倍的唾液 7.冰水浴【实验步骤】1制管和
10、预温由于本实验对恒温反应要求较高，故每个温度梯度使用两支试管，分别标记为 A 管和 B 管，同时欲温底物与酶。A 管加入 PH6.8 的缓冲液和 0.5%淀粉液；B 管使用移液枪加入稀释 100 倍的唾液，相对应的两支试管置于设定的温度下预温 5min。取 12 支洁净试管，参照下表加入试剂：*6 号管为对照组（比色时作为 0 号管） ，置于室温，且淀粉液用蒸馏水代替管号 1（0 ） 2（室温） 3（37 ） 4（50 ） 5（70 ） 6（室温）PH6.8 的缓冲液（ml）2 2 2 2 2 2A 含 NaCl的 0.5%淀粉液（ml）2 2 2 2 2用 2ml的蒸馏水代替B稀释 100倍
11、的唾液（ml）1 1 1 1 1 12混合 A、B 管将 1 号 A 管试剂迅速加入温度对应的 B 管中(为了最大限度保证酶的量)，此时为计时的起点（使用秒表） ，摇匀后放回对应温度继续水浴。注意：转移 A管试剂前需将其摇匀。3时间控制然后每隔 1min 或 2min（时间自定）按上步操作依次把 2、3、4、5、6 号的 A、B 管混合 ，严格控制好时间。4中止反应准确反应 13min，向 1 号管加入 2 滴 1M HCl 溶液，立即混匀，中止反应，按上一步的顺序和时间间隔依次对各管进行操作，并移至试管架。后再各用 2滴 1M NaOH 溶液中和每管。5显色在每管中各加入 2ml 0.031
12、75g/L 碘液并混匀，观察现象。6比色若不同温度梯度间现象差别不明显，则进行比色，通过光密度值来比较。【结果处理】记录现象（或比较吸光度值） ，做出合理分析。【注意事项】严格注意时间的控制及各物质的添加量。【思考题】如果某同学（没有严格按照教案步骤）做出的实验结果为唾液淀粉酶的最适温度为 70 度，请分析他得出这样的结果的可能原因。实验（三）PH 对酶活性的影响【实验目的】了解 PH 对酶活性及酶促反应速度的影响，加深对酶特性的认识。【实验原理】1.PH 对酶活性影响的机理：PH 影响酶活性中心的某些必须基团的解离,而这些基团往往仅在某一解离状态时才最容易同底物结合或具有最大催化活性；PH影
13、响可解离基团的底物和辅酶的荷电状态,从而影响酶对他们的亲和力；PH 还可以影响酶活性中心的空间构象,从而影响酶的活性。2.本实验用唾液淀粉酶为材料来观察酶活性受 PH 的影响的情况。淀粉在该酶的催化作用下会随着时间的延长而出现不同程度的水解,从而得到各种糊精乃至麦芽糖,少量葡萄糖等水解产物。碘液与淀粉及其不同程度的水解产物反应呈现不同颜色,即淀粉(蓝色)、紫色糊精(紫色)、红色糊精(红色)、麦芽糖及少量葡萄糖(黄色)。【仪器与试剂】仪器：1、冰箱 2、电炉 3、恒温水浴锅 4、试管架及试管5、移液管架及移液管试剂：1、0.2M 磷酸氢二钠溶液：称取 35.61g 含 2 个结晶水的磷酸氢二钠，
14、用水定容至 1L。2、0.1M 柠檬酸溶液：称取 21.01g 含一个结晶水的柠檬酸，用水定容至1L。3、唾液淀粉酶：将唾液分别稀释 10 倍、50 倍和 100 倍，得三种不同浓度的酶液、4、0.5%淀粉的 0.5%氯化钠溶液： 0.5g 可溶性淀粉和 0.5g 氯化钠，溶于100ml 蒸馏水（需加热） 。5、0.1%淀粉液：0.1g 可溶性淀粉，加到 100ml 蒸馏水中，加热溶解。6、碘液：15g 碘化钾和 12.7g 碘，加少许水使碘完全溶解后，再用水稀释至 200ml。7、1% 氯化钠溶液。8、0.1%硫酸铜溶液。【实验步骤】（一）PH 对酶活性的影响1、缓冲溶液的配制取六只洁净的三
15、角烧瓶，按表 1 编号和加试剂：表 1 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的配制取六支洁净试管，编号后按表 2 操作：表 2 pH 对酶活性的影响管号 1 2 3 4 5 6PH 值 5.4 6.2 6.8 7.0 7.4 8.0缓冲液量（ml） 3 3 3 3 3 3含 Nacl 的 0.5%淀粉（ml） 2 2 2 2 2 2稀释 100 倍唾液（ml） 2 2 2 2 2 2充分摇匀，37水浴保温，严格控制时间 5min 后，立即向各管加入碘液碘液（滴） 3 3 3 3 3 3充分摇匀，观察各管颜色差异三角烧瓶号 1 2 3 4 5 6PH 值 5.4 6.2 6.8 7.0 7.4 8.00.2
16、M 磷酸二氢钠（ml ） 11.15 13.22 15.45 16.47 18.17 19.450.1M 柠檬酸（ml ） 8.85 6.78 4.55 3.53 1.83 0.55【结果处理】记录现象（或比较吸光度值） ，做出合理分析。【注意事项】充分摇匀，严格控制时间。【思考题】酶的最适 PH 值受哪些因素影响？实验（四）酶浓度对酶活性的影响【实验目的】了解酶浓度对酶活性及酶促反应速度的影响，加深对酶特性的认识。【实验原理】在适宜的条件下，若反应物浓度大大高于酶浓度时，反应速度随酶浓度增加而增加，两者间成正比。但若反应底物浓度较低，而且酶的浓度足够高时，增加酶浓度，反应速度基本不变。本实验
17、采用唾液淀粉酶为例。加入不同浓度的酶，并比较在同一适当时间后，以碘检验淀粉的含量从而确认其反应程度。【仪器与试剂】仪器：1.恒温水浴锅 2.吸量管3.试管与试管架试剂：1.含 NaCI 的 0.5%淀粉液2.pH7.0 的缓冲液3.分别稀释过 10 倍、50 倍和 100 倍后的唾液【实验步骤】1.取 3 支洁净试管，按下表加入淀粉液，缓冲液，加毕放入 37 度恒温水浴锅中保温 5 分钟；2.保温后，快速加入不同浓度的稀释唾液，摇匀，立即放入 37 度恒温水浴中，并计时。约 3 至 4 分钟后加入等量碘液一至两滴，立即摇匀后，记录各管的颜色。稀释唾液 /mL管号 含 NaCI 的0.5%淀粉液
18、/mLpH7.0 的缓冲液/mL 10 倍 50 倍 100 倍颜色1 3 2 12 3 2 13 3 2 1【结果处理】记录现象，做出合理分析。【思考题】实验（五）离子对酶活性的影响【实验目的】了解离子对酶活性及酶促反应速度的影响，加深对酶特性的认识。【实验原理】酶的活性常常受某些物质的影响，有些物质能使酶的活性增加，称为酶的激活剂；有些物质能使酶的活性降低，称为酶的抑制剂。Cl -是唾液淀粉酶的激活剂。其它的阴离子，如 Br-、NO 3-和 I- 对该酶也有激活作用，但较微弱。而Cu2+对唾液淀粉酶具有抑制作用。激活剂和抑制剂影响酶活性的剂量是很少的，并且常具有特异性。就本实验，低浓度 C
19、I-可以增加酶活性，高浓度的 CI-或者低浓度的 Cu2+则会抑制酶活性，同时低浓度的 Na+、SO 42-等对酶活性没有影响。激活剂的作用机制是多种多样的，可能是作为辅酶或辅基的一个组成部分，也可以直接作为酶活性中心的构成部分。【仪器与试剂】仪器：1.恒温水浴锅2.吸量管3.试管与试管架试剂：1. 1%NaCI 溶液2. 0.1%CuSO4 溶液3. 0.1%淀粉液4. 100 倍稀释唾液5.碘液【实验步骤】取 3 支洁净的试管，编号后按下表操作：管号 1 2 31%NaCl(mL) 10.1%CuSO4(mL) 1蒸馏水（mL ） 10.1%淀粉液（mL） 3 3 3100 倍稀释唾液（mL） 1 1 137恒温水浴 15min，取出滴加碘液碘液 2 2 2结果【结果处理】记录现象（或比较吸光度值） ，做出合理分析。【思考题】为什么加入淀粉后有试管内颜色显现为红色？（思考题可以总结起来出在最后面）
