1、现代分子生物学实验手册工具酶基因工程：在人工可以控制条件下，将基因剪切或重新组合，再导入另一生物体内，使这些基因在其中表达并遗传下去的一门技术。 核心：对基因进行人工切割、连接和重新组合，构建重组 DNA。工具酶：在基因工程的重组 DNA 过程中，所需要用到的酶的统称。1、限制性内切酶（restriction endonuclease）主要功能：对外源性的双链 DNA 进行切割、水解，不允许外源性 DNA 存在于细菌自身细胞内。 （这种酶能对在自身细胞内存在的 DNA 种类给予限制限制性内切酶）限制-修饰系统：合成限制性内切酶的细胞，其自身的 DNA 不受酶的切割，这是因为细菌细胞还会合成一种
2、修饰酶，可以对自身 DNA 进行修饰，即改变DNA 原来具有的可以被限制性内切酶识别的核酸顺序结构，从而不被限制性内切酶识别及切割、水解。 保护自身遗传物质稳定的机制。限制性内切酶：从原核生物中发现的，约 600 种，可识别 108 种不同的特定 DNA 顺序。以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生 DNA 片段的 5端为 P，3 端为- OH。命名：获得该酶的细菌属名的第一个字母（大写）+该菌种名的前两个字母(小写)+ 株系的字母（小写）或数字+罗马数字（同一株菌种不同内切酶的编号）例：细菌属名 细菌种名 菌株名称 限制酶名称Arthrobacter luteus Alu IEscheri
3、chia coli RY13 EcoR IBacillus amyloliquefaciens H HamH IHaemophilus influenzae Rd Hind III（一）三种常用内切酶1. I 型限制性内切酶同时兼有切割 DNA 的功能和修饰酶的修饰功能。在酶的识别位点上，若 DNA 两条链菌没有发生甲基化，则行使内切酶的功能，对 DNA 进行切割，同时转变成 ATP 酶。若 DNA 双链中有一条链已发生甲基化，则此类酶显示修饰酶的作用，对另一条 DNA 进行甲基化修饰，然后在行切割功能。 （实际上，有内切酶、修饰酶、ATP 酶及解旋酶四种功能）I 型限制性内切酶在 DNA 链
4、上的识别位点和切割位点不一致，也不固定。没有时间应用价值。【DNA 甲基化：DNA 化学修饰的一种形式，能在不改变 DNA 序列的前提下，改变遗传表现（外遗传机制）。 多发生于 CpG 二核苷序列上（在甲基转移酶的催化下，DNA 的 CG 两个核苷酸中的胞嘧啶被选择性添加甲基，形成 5-甲基胞嘧啶）。 甲基化位点可随 DNA 的复制而遗传（DNA 复制后，甲基化酶可将新和成的未甲基化的位点进行甲基化）。 DNA 甲基化可引起基因组中相应区域染色质结构变化，使 DNA 失去限制性内切酶的切割位点，以及DNA 酶的敏感位点，使染色质高度螺旋化，凝缩成团，失去转录活性。】2. III 型限制性内切酶
5、具有内切酶和甲基化修饰酶作用。具有专一的识别顺序，其切割位点在识别顺序旁边的几个核苷酸对的固定位置上。（可识别短的不对称序列，切割位点与识别序列约距 2426bp）3.II 型限制性内切酶也具有限制-修饰系统，但由限制酶和修饰酶这两种不同的酶共同来执行这一系统的功能。即 II 型限制性内切酶有在识别位点的切割功能，而不具备甲基化修饰活性，修饰作用由相应的修饰酶完成。 两种酶识别同一 DNA 特定序列，却发挥不同作用。能识别双链 DNA 的特异顺序，并在该顺序内的固定位置上进行切割，产生特异的 DNA 片段。II 型限制性内切酶的识别位点和切割位点是专一和固定的，对相同的基因片段的切割，总是得到
6、同样核苷酸顺序的小 DNA 片段。这些切割后的不同大小的 DNA 片段，可以与统一内切酶切割后的来源不同的其他 DNA 片段实行连接，而构建重组 DNA。基因工程技术的核心II 型限制性内切酶识别的专一核苷酸顺序，最常见的是 46 个碱基对。II 型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序（反转重复顺序），具有 180的旋转对称性。识别顺序有一个中心对称轴，从这个轴朝两个方面读序都是相同的。这类酶切割 DNA 可有两种形式。交错切割方式：每种酶切割后个产生两个 DNA 片段，每一个片段个含有一个单链末端，单链末端是互补的，可以通过形成“氢键”而黏合。不同来源的两条 DNA 片段经同一种酶切割后
7、，产生互补的黏性末端，通过选择合适的 DNA 链接，可将两条异源性 DNA 片段组合在一起。 重组DNA 的最基本原理用选择专一性不同而产生相同黏性末端的两种酶切割两条不同的 DNA 片段，可使重组后的 DNA 片段不再被原来的酶所切割。如：Sal I 酶切割后产生的黏性末端 ，Xho I 酶切割后产生的黏性末端，两者经连接酶连接产生的序列 ，既不被 Sal I 酶切割，也不被 Xho I 酶切割。在同一位置上切割 DNA 双链，产生平头末端。如： （二）其他类型内切酶1.同工酶（Boschizomer）：来源不同的两种 II 型内切酶，它们识别核苷酸顺序及切割位点都相同，差别只在于当识别核苷
8、酸序列中有甲基化的核苷酸时，一种内切酶可以切割，而另一种不能。如：Hpa II 和 Msp I 识别顺序都是 5CCGG3，若其中有 5-甲基胞嘧啶，则只有Msp 酶可切割（GGmCC ）。2.Subset 酶： 识别顺序及切割位点相互有关的酶，互称 Subset 酶。如：Sam I 酶所识别的 6 个核苷酸顺序中含有 Hpa II 酶识别的 4 个核苷酸顺序。所以这两个酶可以相互代替使用，它们所切割的 DNA 片段可以相互连接。3.可变酶（特殊的）：识别核苷酸顺序一般都大于 6 个，但其中一个或几个核苷酸时可以变化的。4.远距离切割酶：识别核苷酸顺序的位置与切割的位点不一致，一般切割位点与指
9、标核苷酸顺序的位置之间有 10 个左右核苷酸的距离。 与 I 型内切酶相似，不过 I 型内切酶识别位点与切割位点的距离更远一些。（三）甲基化酶（不属于内切酶）使识别顺序中的某个核苷酸发生甲基化，保护 DNA 不被限制性内切酶切开。M5C（5-甲基胞嘧啶）大多数以 M5CpG 的形式存在，即 CpG 岛中的 C 最容易是甲基化的底物，而甲基化又与受之调控的基因的表达程度有关。因此，研究 CpG 岛的甲基化是研究基因调控的一个重要方向。当甲基化酶和限制性内切酶共同使用时，常常可以使有多个识别位点的内切酶只对其中一个识别位点有切割效果，其他位点因被甲基化酶修饰而不能被切割。如：限制性内切酶 Ava的
10、识别顺序是 Py 可以是任何一种嘧啶，pu 可以是任何一种嘌呤。因此可以有 4 种识别顺序。如果同时使用甲基化酶 Taq和甲基化酶 Hpa，则 Ava的识别顺序将只是5CCCGAG3。如上图，一个基因片段被 Ava I 酶切割时，片段中有三个 Ava I 酶识别顺序，该片段被切割成 4 个片段。 但若先用 Taq I 甲基化酶和 Hpa II 甲基化酶作用该片段时，片段中某些核苷酸发生甲基化修饰而不能被切割，再用 Ava I 酶切割时，只能被切割成两个片段。【一甲基化酶对 DNA 的某位点进行甲基化修饰，进而抵御内切酶的切割构建重组质粒】（4）与 内切酶相关的几个概念1.酶活性单位及标准反应体
11、系酶活性单位：在一定温度、PH 及离子强度下，1h 内完全酶解（切割）特定底物 DNA，所需限制内切酶的量。 （底物 DNA：多用 噬菌体 DNA。又是可以用某一种酶在 噬菌体 DNA 上的切割位点，来推算用这种酶切割这种DNA 时所需的活性单位。）标准反应体系：在 50l反应体系及指定温度下，使用特定的缓冲体系，用1 个活性单位的限制内切酶，酶解 1g底物 DNA 反应 1 个小时。 （若底物比 1g多或少，可参照标准体系比例增加或减少酶用量。但增加酶用量时，需注意不可加量过多内切酶中通常含有甘油防冻剂，加入酶量过多，其中的甘油会降低内切酶识别顺序的特异性。 也可通过延长反应时间来保证完全的
12、酶切。）2.星号活力限制性内切酶在非标准反应条件下，切割一些与特异性识别顺序相类似的顺序活性（该酶的第二活性）。 （产生许多不想得到的片段；内切酶的识别切割能力下降，识别特异性下降。）引起星号活力的因素：过高的甘油含量（5%）；低盐离子强度（【切口平移：切口产生 3羟基和 5磷酸基团，DNA 延伸合成 3端，5端被小片段降解，缺口位点沿着双链向 3端移动，是在体外向 DNA 分子引入放射性标记核苷酸的技术。】2.噬菌体 DNA 聚合酶T4 DNA 聚合酶，也具有 53聚合酶活性和外切酶活性。外切酶活性比大肠杆菌 DNA 聚合酶外切酶活性强 200 倍。 可用于探针的放射性核素标记。3.噬热水生
13、菌 DNA 聚合酶从噬热水生菌 Themus aquaticus YT-1 菌株中分离得到。 耐热其中 Taq DNA 聚合酶使用最多。 7075生物活性最高。在 7580条件下，每个酶蛋白分子每秒可以延长 150 个核苷酸被广泛应用于体外扩增特异性 DNA 片段的技术（聚合酶链式反应，PCR）（2）RNA 聚合酶能利用 DNA 作为模板，催化四种核糖核苷三磷酸（NTP）底物合成 RNA。I:核仁中，转录 rRNA 顺序II：细胞质中，转录大多数基因（蛋白质基因和部分核内小 RNA 基 因），转录是需要“TATA”框（酶开始结合的位置，启动子， II 型转录单位特有的）。当双链 DNA 分子的
14、一条链上产生切口时，E.coli 聚合酶 I就可以将核苷酸连接到切口的 3-OH 末端。同时该酶具有 53的核酸外切酶活性，能从切口的 5端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的 3端补上核苷酸，从而使切口沿 DNA 链向 3端移动。RNA 聚合酶III：细胞核质中，转录 tRNA、5SrRNA 基因等少数几个基因。（核质：由单一密闭环状 DNA 分子反复回旋卷曲盘绕组成的松散 网状结构。 无核膜、核仁）（3）DNA 连接酶 基因工程比用的工具酶T4 DNA 连接酶（T4 DNA ligase） Mg 2+依赖性酶催化双链 DNA 上具有相邻的 3羟基和 5磷酸末端单链缺口的修复，以及具
15、有黏性末端或平端的 DNA 片段的端端连接的酶。DNA 连接既可发生在 DNA 分子之间，也可发生在分子内部。 高浓度的DNA 末端有利于分子间连接，低浓度则有利于环状 DNA 分子的形成。DNA 连接酶只能连接双链 DNA 而不能连接单链 DNA。（4）反转录酶（逆转录酶，reverse transcriptase）以 RNA 为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成互补 DNA（cDNA）的酶。需要 Mg2+、Mn 2+作为辅助因子。反转录酶可用来把任何基因的 mRNA 反转录成 cDNA 拷贝，然后可大量扩增插入载体后的 DNA。 可用来标记 cDNA 作为放射性的分子探针。（5）核糖核苷酸 A（
16、RNase A，ribnuclease A）核酸内切酶。 特异的攻击 RNA 上嘧啶残基的 3端，切割与相邻核苷酸形成的磷酸二酯键，产生 3-磷酸嘧啶核苷酸和以 3-磷酸嘧啶核苷酸结尾的寡核苷酸（一类只有 20 个以下碱基的短链核苷酸的总称。 寡核苷酸可以很容易地与它们的互补对链接，所以常用作探针确定 DNA 或 RNA 的结构）。高浓度时，可对单链 RNA 的任何位点进行切割；低浓度时，只切割 C 和U 的位点。检测寡核苷酸片段中是否含有 C 和 U。有显著的细胞毒性。RNase A 可用于检测基因突变：利用 RNA 探针与突变基因形成 RNA-DNA杂交体时，突变点处不能产生碱基互补（局部
17、单链）这一特点，用 RNase A 进行切割，切割产物可通过跑变性胶得到分离，可用放射自显影等其他方法检查片段数目及大小，从而推知发生突变的位点。 RNA 探针可通过将相应的DNA 片段克隆至含有 SP6 或 T7 启动子的载体中得到。在操作 RNA 的实验时一定要戴口罩和手套（RNase A 存在非常广泛，人唾以 RNA 为模板时，在反转录酶作用下，先合成单链 DNA（ss DNA）。再在反转录酶和 DNA 聚合酶 I作用下，以单链 DNA 为模板合成“发夹”型的双链 DNA（ds DNA）。最后在核酸酶 S1 作用下，切割成两条单链 DNA。液、汗液中均含有），以避免有 RNase 的污染
18、，所用的容器及蒸馏水也都必须经去 RNase 处理 。【用 DEPC 处理：0.1 100 比例加 DEPC，37 12h，高温5min 除去 DEPC 残留。含 Tris 的溶液不能用 0.1%DEPC 处理（DEPC 会和 Tris 的氨基反应而降解，失去灭活 RNase 的能力），通常可改用 DEPC 处理过的水来配DEPC，已配好的可用 1%DEPC 处理（不过会有 DEPC 残留）。】（6）核糖核酸酶 T1 （RNase T1 ）核酸内切酶。特异地攻击鸟苷酸 3侧的磷酸基团，切割与其相邻核苷酸的5-磷酯键，产生 3-磷酸鸟苷和以 3-磷酸鸟嘌呤核苷酸结尾的寡核苷酸。主要用于 RNA
19、测序和指纹图谱分析/也可和 RNase 合用，以除去样品中RNA；除去 DNA-RNA 杂交体中杂交体的 RNA 区。（7）核糖核酸酶 H（RNase H）核酸内切酶。 水解 RNA-DNA 杂交体中的 RNA 链，产生 5-磷酸寡核苷酸和 5-磷酸核糖核苷。 使 RNA 被切割后成为 DNA 聚合酶合成第二条 cDNA 的引物，形成cDNA。（8）脱氧核糖核酸酶 I（DNase I，deoxyribonuclease I）核酸内切酶。 Mg2+条件下，随机切割单、双链 DNA，产生 5磷酸末端的单脱氧核苷酸和寡脱氧核苷酸。Mn 2+存在下能将双链 DNA 同时切断，是 DNA 片段化。其活性
20、依赖于 Ca2+（辅因子），活化剂： Mg2+，抑制剂：螯合剂（EDTA等）DNase 污染：用具要高温处理，样品中加 EDTA，抑制酶活性；或冰水中灭活。、用途：除去 RNA 样品中污染的基因组 DNA；转录反应后 DNA 模板的降解。（9）核酸酶 S1（nuclease S1）内切酶（高度单链特异）。酶解单链 DNA、单链 RNA，产生 5-磷酸的单核苷酸或寡核苷酸。对双链 DNA、双链 RNA 和 DNA-RNA 杂交体相对不敏感。需要低水平的 Zn2+激活， PH4.04.3，抑制剂：螯合剂（EDTA、柠檬酸等）、磷酸缓冲液、和 0.6%左右的 SDS 溶液。S1 核酸酶的水解功能可以
21、作用于双链核酸分子的单链区，并从单恋部分切断核酸分子，且这种单链区可以小刀只有一个碱基对的程度。去除 DNA片段中突出的单链末端；切开合成 ds DNA 时形成的“发夹”结构。（10）核酸酶 Bal 31水解超螺旋 DNA 成开环状，进而成为线状 DNA。有外切酶活性，在 Mg2+、Ca 2+参与下，能从 DNA 双链两端连续向中间切割水解。可用于 DNA 链的限制性内切酶切割位点分析（绘制 DNA 限制图谱）；缩短 DNA 片段。（11）核酸外切酶（exonuclease）是具有从 DNA 分子链的末端顺次水解磷酸二酯键而生成单核苷酸作用的酶。两种：水解磷酸二酯键的 5端生成 3-单核苷酸的
22、酶；水解磷酸二酯键的 3端生成 5-单核苷酸的酶（大肠杆菌核酸外切酶 I、II 和 III）。核酸外切酶 III：从双链 DNA3OH 逐一降解切除 5单核苷酸。不降解单链 DNA 或 3突出的双链 DNA。具有多种酶活性：对无嘌呤 DNA 特异的核酸内切酶活性、3磷酸酶活性、3外切酶活性、RNase H 活性。核酸外切酶 III 与核酸酶 S1 合用可使克隆的 DNA 分子产生缺失（delection，DNA 链上一个或一段核苷酸的消失）。 【核酸外切酶 III 与底物的每次结合，只切除最末的几个核苷酸，从而使双链 DNA 产生渐进缺失。最适底物：平末端或 3凹陷末端 DNA。 3突出末端抵
23、抗该酶的切割，抗拒程度岁 3突出末端的长度而改变（4 碱基完全不能被切割）。 对于一端是抗性位点（3突出端），一端是敏感位点（5突出端或平末端）的线性 DNA分子，可以产生单向缺失。Eg：将双链 DNA 用产生不同末端的限制性内切酶双酶切后，利用 Exo III 的 35的外切酶活性，从一端降解，得到互补的单链 DNA 和 5-单核苷酸。 与Bal 31Nuclease 相比，碱基特异性小，如在富含 GC 的位置上，由于反应停止的机率较低，可用于 DNA 的 Delection 制作。】（12）多核苷酸激酶（polynucleotide kinase） 催化磷酸基从 ATP 转移到 DNA、R
24、NA、寡核苷酸等分子的 5-羟基末端。用途：对缺乏 5-磷酸的 DNA 或合成接头磷酸化；对 5OH 末端进行同位素标记 。标记底物为r 32P-ATP。 一般天然存在的核酸不存有 5-羟基而有 5-磷酰基，标记时，应先用碱性磷酸酯酶将 5-磷酰基除去（脱磷）。（13）碱性磷酸酯酶（alkaline phosphatase ）除去 DNA、RNA 的 5-磷酰基，防止片段间彼此连接（自身环化）。标记（5 ）前除去 DNA 或 RNA 的 5-磷酰基。（14）末端转移酶（TdT，terminal deoxynucleotide transferase）一种不需要引物就能将脱氧核苷三磷酸（dNTP）加到某 DNA 片段上 3-OH 上的酶。可进行 DNA3末端加尾和标记。
