结核病诊断技术.doc

1、第 2 章 实验室检验技术结核病实验室检查，特别是细菌学检查是结核病确诊和治疗的主要依据。结核病细菌学检验主要包括 4 项基本技术，即涂片染色镜检、分枝杆菌分离培养、分枝杆菌药物敏感性试验、分枝杆菌菌种鉴定。检验人员应依据临床医师检验申请要求并结合实验室的设备和技术条件，负责对标本进行检验，及时、准确地填写检验报告。 近年来，国内、外研究者在分子生物学、分子微生物学及免疫学领域建立了若干快速、敏感、特异的检测新技术，为可疑结核病患者的早期诊断与合理治疗带来了新的希望。列入“规范”的结核杆菌临床基因扩增(PCR)检验技术、分枝杆菌快速培养及药物敏感性试验技术、免疫学检测技术，因有多种试剂盒(试剂

2、)及分析仪器可供选择，目前尚难制定统一的技术操作规范，故暂定为辅助操作技术。具备开展这些技术项目条件的实验室(或检验科)，须经有关主管部门批准后，严格按照相应技术所附的说明书与操作规程实施。 鉴于结核病实验室检查，特别是细菌学检查在结核病控制工作中的重要性，为保障相应检查项目结果的可靠性，要求相应的检查项目必须由经过培训并考核合格的专职人员完成，且开展相应检查的实验室应具备安全操作设施，制定实验室内部质量控制措施，同时接受专业结核病实验室的质量控制督导和培训。第一节 结核茵检验实验室安全操作规则结核病细菌学实验室必须具有与其服务级别相应的装备，其原则是能满足该级别实验室的需要，使实验室工作人员

3、得到充分的防护，并避免造成环境污染。 1实验室应有合理布局及合适的单向(外排)通风体系。 2实验室应配备相应的防护设备，以保护工作人员的安全和实验工作的顺利进行。分离培养、药物敏感性测定、菌种鉴定试验等操作应设有生物安全操作柜或接种间和通风橱等。 3实验室工作人员应按正确方式进行技术操作，穿戴隔离衣、口罩和帽子等。 4实验室所有带毒废弃物应灭菌及无害化处理。 5建立清洁消毒制度，限制非工作人员进入室内，禁止在实验室饮食和吸烟等。 6进行下列操作时应严格按照技术操作规范，防止产生细菌气溶胶：涂片制作；培养液的倾倒和转移；高速混合含菌液体；滴加、接种培养物；吸管稀释和混合菌悬液；取样器和振荡器的使

4、用；细菌细胞超声粉碎；感染动物实验等。 第二节 标本的采集、运送和保存初诊患者应送 3 份痰标本(夜间痰、清晨痰和即时痰)。如无夜间痰，在留取清晨痰后 23h 再留取 1 份痰标本，或在送检时，留取 2 份即时痰。疗程中或复诊随访患者按期每次送检 2 份痰(清晨痰和夜间痰)。 一、痰标本的采集1即时痰为病人就诊时咳出的痰液；清晨痰为就诊当天清晨深咳出的痰液；夜间痰为就诊前夜咳出的痰液。合格的痰标本应是脓样、干酪样或脓性黏液样痰液，痰量应为 35ml。 2痰标本应由检验人员或经培训合格的专人验收，痰液不合格者，要求重新送检。难以获得合格标本时，也应进行细菌学检查，但应注明标本性状，以便分析结果时

5、参考。 3留取痰标本的容器应为广口、直径 4cm、高 2cm、有盖密闭的塑料盒或蜡纸盒，容器上应注明患者姓名、编号(门诊序号或患者登记号)及送检日期。 二、痰标本的保存和运送留取痰标本后，应将容器密封，切勿倒置，严防痰液外溢。需外送检查的标本应认真核对痰盒上的标注是否正确清晰，是否与检验单一致，痰容器应采用专用的冰盒，或以纸张和塑料袋封装、扎牢，顺序放置于包装袋内，注明盒盖向上的标示，严防运送途中倒置。当天不能检查的痰标本须置 4冰箱保存。三、其他标本的采集、运送和保存1尿液及胸、腹水标本留全量夜尿或胸、腹水，静置 45h 后，弃上清液，取沉淀部分至少 10ml 送检。 2大便、脓液、病灶组织

6、或干酪块、脑脊液标本 应至少留取或采集23ml (g)，采集后立即送检。 3标本运送和保存可参考本节痰标本的保存和运送。 第三节 涂片检查法一、玻片的准备取经 95乙醇擦拭脱脂的干燥、清洁、无油污、无划痕的新玻片，于玻片背面的左端 13 处用玻璃笔编号。一张玻片只能涂抹一份痰标本，每张玻片只能使用 1 次，不得清洗后再次用于抗酸染色检查。 二、直接涂片法1痰液及脓液用接种环或专用竹签挑取标本的脓样、干酪样部分00501ml，于玻片正面的右侧 23 中央处均匀涂抹成 2cm25cm 椭圆形痰膜，自然干燥。 2病灶组织或干酪块先用组织研磨器磨碎后再行涂片。 3尿液及胸、腹水标本 留全量夜尿或胸、腹

7、水，静置 45h 后，弃上清液，取沉淀部分约 10ml，经 60008000rmin(60008000rpm)离心 20min，取沉渣涂片。 4脑脊液无菌操作收集脑脊液，放置冰箱或室温 24h，薄膜形成后涂片。也可将脑脊液经 60008000rmin 离心 20min，弃上清液，取沉淀物涂片。 5粪便标本与生理盐水混匀后，充分振荡使之成为混悬液；定性滤纸过滤后，滤液经 60008000rmin 离心 20min，取沉淀涂片检查。 6咽喉棉拭子 棉拭子放入无菌试管，加入适量生理盐水浸泡，并强烈振荡，取出棉拭子后，液体经 60008000rmin 离心 20min 后，取沉淀涂片检查。三、集菌涂片

8、法1漂浮集菌法 取深咳痰或 1224h 痰液经 121高压灭菌 15min，待冷却后，取 510ml 盛于容积为 100ml 的玻璃容器中(口径约 2cm)，加灭菌蒸馏水20 30ml，总体积勿超过容器的 13，加二甲苯 03ml，放振荡器振荡10min，取出，加蒸馏水至满瓶口，将已编号的载物玻片盖于瓶口上，静置20min，取下载玻片，自然干燥，火焰固定，染色镜检。 2离心集茵法 取深咳痰或 1224h 痰液经 121高压灭菌 15min，待冷却后，取 510ml 盛于容积为 500ml 的离心管中，加水至 50ml，经60008000r min 离心 20min 后，取沉淀涂片检查。 四、染

9、色、镜检方法(一)萋尔一尼尔逊抗酸染色法 萋尔一尼尔逊(ZiehlNeelsen)抗酸染色法，简称萋一尼氏染色法。 1染色液 染色剂08苯酚(石炭酸)复红溶液 脱色剂5盐酸乙醇液 复染剂03亚甲蓝溶液 2染色步骤 (1)涂片自然干燥后，火焰固定。 (2)滴加复红染色剂盖满痰膜，小心火焰加热，出现蒸汽后脱离火焰，保持染色 3min。染色期间应始终保持痰膜被染色液覆盖，必要时可续加染色液。加温时勿使染色液沸腾。 (3)流水自玻片背面上端轻洗，洗去染色液。 (4)自痰膜上端外缘滴加脱色剂，流过痰膜，须脱至痰膜无可视红色为止。脱色应单片进行。 (5)流水自玻片背面上端轻洗，洗去脱色液。 (6)滴加亚甲

10、蓝复染剂，染色 30s。 (7)流水自玻片背面上端轻洗，洗去复染液。 (8)待干后镜检。 3镜检与报告 (1)用双目光学显微镜(目镜 10，油镜 100)镜检，在淡蓝色背景下，抗酸杆菌呈红色，其他细菌和细胞呈蓝色。 (2)按照下列标准报告镜检结果 抗酸杆菌阴性(一)：连续观察 300 个不同视野，未发现抗酸杆菌。 报抗酸杆菌数：18 条抗酸杆菌300 视野。 抗酸杆菌阳性(1+)：39 条抗酸杆菌100 视野。 抗酸杆菌阳性(2+)：19 条抗酸杆菌10 视野。 抗酸杆菌阳性(3+)：19 条抗酸杆菌每视野。 抗酸杆菌阳性(4+)：10 条抗酸杆菌每视野。 (二)荧光染色法 1染色液 (1)染

11、色剂：01金胺“O”(Auramine O)溶液 (2)脱色剂：3盐酸乙醇液 (3)复染剂：05高锰酸钾水溶液 2染色步骤 (1)涂片自然干燥，经火焰固定。 (2)加染色剂 1015min，水洗。 (3)加脱色剂 12min 至无黄色，水洗。 (4)加复染剂 12min，水洗，待干镜检。 3镜检与报告 (1)在暗色背景下，抗酸杆菌呈黄绿色或橙色荧光。必须用 40物镜确认菌体形态，应具有萋一尼氏抗酸染色镜检经验后，方可应用荧光染色法，荧光法难以确认时，应进行萋一尼染色检查，以免错判或漏判。荧光染色后涂片应在 24h 内检查，如须隔夜，置 4保存，次日完成镜检。 (2)物镜 20检查结果按下列标准

12、报告 荧光染色抗酸杆菌阴性(一)：0 条50 视野。 报荧光染色抗酸杆菌数：19 条50 视野。 荧光染色抗酸杆菌(1+)：1099 条50 视野。 荧光染色抗酸杆菌(2+)：19 条每视野。 荧光染色抗酸杆菌(3+)：1099 条每视野。 荧光染色抗酸杆菌(4+)：100 条每视野。 物镜 40检查细菌细胞形态。 五、涂片检查法质量控制应建立室内、室间痰片检验质量控制制度。 室内质控应包括痰标本收集、痰片染色和镜检结果复验。室内质控应每季度进行 1 次，痰涂片应保存供上一级参比实验室(或质控机构)质量控制检查。 室间质控可定期进行，阳性痰涂片符合率应98，阴性痰涂片符合率应 96，(1+)以

13、上的阳性片不允许出现假阴性。 六、废弃标本和污染物的处理痰盒和废弃标本等污染物，均须经高压蒸汽灭菌后才能丢弃或清洗，严禁不经灭菌随意处理。 痰盒等污染物如采用焚烧处理，须置于焚烧炉内彻底焚化。焚烧不彻底或暴露焚烧是有害的。 痰检工作面的消毒：可将痰标本置于一搪瓷盘中，在操作橱内进行痰涂片操作。操作完毕后将盘与废弃物一并进行高压蒸汽灭菌，或与操作台面同时以3苯酚(石炭酸)或其他可靠消毒液擦拭后，再以紫外线灭菌灯(距离12m)照射 30min。 附录 1：萋-尼氏染色试剂的配制 18苯酚复红染色剂 碱性复红乙醇贮存液(碱性复红 8g，溶于 95乙醇 100m1 中)10ml，加 5苯酚水溶液至 1

14、00ml，混匀。 25盐酸乙醇脱色剂 浓盐酸 5ml 加 95乙醇至 100ml，混匀。 303亚甲蓝复染剂 亚甲蓝 03g 加 95乙醇 50ml 待溶解后，加蒸馏水至 100ml，混匀，即为贮存母液，使用时 10 倍稀释。 附录 2：荧光染色试剂的配制 11金胺“O”染色液 金胺“O“01g 溶于 95乙醇 10ml 内，加 5苯酚至 100ml，混匀。 23盐酸乙醇脱色液浓盐酸 3ml 加 95乙醇至 100ml，混匀。 305高锰酸钾复染液 05g 高锰酸钾加蒸馏水至 100ml，混匀。 第四节 分枝杆菌分离培养检查法分枝杆菌属(Mycobacterium)迄今报道有 100 多个种。

15、伯杰系统细菌学手册将分枝杆菌菌种划分为两大类：缓慢生长分枝杆菌与快速生长分枝杆菌。在营养丰富的培养基上，接种很稀的新鲜培养物，在适宜培养温度下。7d 以上肉眼可见单个菌落，称为缓慢生长分枝杆菌，其代表菌种是结核分枝杆菌(Mtuberculo sis)。在上述条件下，7d 以内肉眼可见单个菌落，称为快速生长分枝杆菌。分枝杆菌属，除结核分枝杆菌复合群(结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌)及麻风分枝杆菌外，余者统称为非结核分枝杆菌(Nontuberculosis Myco bacteria，NTM)。 结核分枝杆菌是专性需氧菌，最适生长温度为 37，最适 pH 为6572。 对营养

16、要求较高，专嗜甘油作为碳源，天门冬酰胺是最好氮源。 分枝杆菌分离培养检查法，是结核病确诊最可靠的方法。是获得纯培养物进行菌种鉴定、药物敏感性试验以及其他生物学研究的基础。 一、培养基分离培养基采用酸性改良罗氏培养基。 (一)成分 谷氨酸钠(纯度 99以上) 72g 磷酸二氢钾(KH2PO4) 140g 硫酸镁(MgSO47H2O) 024g 柠檬酸镁 06g 丙三醇 12ml 马铃薯淀粉 30g 蒸馏水 600ml 新鲜全卵液 1000ml 2孔雀绿水溶液 20ml 注 1：无机盐试剂应采用化学纯(CP)以上等级的试剂。 注 2：WHO 在“结核病控制实验室工作手册(1998)”中建议分离培养

17、使用无淀粉的改良罗氏培养基。 (二)制备方法 1基础液制备量取蒸馏水 600ml，加入各无机盐成分、谷氨酸钠和丙三醇，溶解后加马铃薯淀粉，混匀，沸水浴 1h 使呈糊状(不时摇动，防凝块)，冷却。 2新鲜鸡卵液制备洗净新鲜鸡卵表面，浸泡在 70乙醇或其他稀释消毒液中 2030min。取出，拭干，开口，收集鸡卵液，搅匀。通过消毒的纱布过滤成鸡卵液。 3培养基制备将 600ml 基础液和 1000ml 新鲜鸡卵液混匀。加入 2孔雀绿水溶液 20ml，混匀，静置 1h 后，分装至标准螺旋盖培养管或灭菌中试管中，每管 7ml。双层放置于搁架中，经培养基蒸汽凝固灭菌器 85凝固灭菌50min。培养基斜面应

18、占试管的 23。制成的培养基应斜面鲜艳，表面光滑，有一定韧性和酸碱缓冲能力。 4培养基保存 制成的培养基经 37无菌试验 24h，检查培养基污染情况后置 4避光保存，1 个月内使用。 二、去污染处理(一)痰标本 视标本性状，加 12 倍体积 4氢氧化钠(NaOH)消化液于痰瓶中，拧紧螺旋盖，涡旋振荡器上振荡 1min，使痰液充分匀化，室温放置。自加入氢氧化钠消化液起，整个处理时间应在 1520min。样本份数较多时，应分批处理。 (二)其他标本 1脓液采用 4硫酸(H2SO4)处理。标本与 4 硫酸(H2SO4)以 1：3 混匀后，静置 25min(其间振荡数次)，按无菌手续接种 01ml 经

19、处理的标本至 LJ 培养基，每份标本接种 2 支培养基。酸处理去污染时间不超过 25min。 2病理组织或干酪块 标本切碎后置于无菌组织研磨器，加入适量(051 容积)生理盐水后充分研磨成混悬液；混悬液经 3000rmin 离心30min 后，沉淀物进行碱处理与 24 倍量 2氢氧化钠(NaOH)混合，处理15min后接种。 3尿液 留全量夜尿，静置 45h，取沉淀部分约 10ml，3000rmin 离心 30min，取沉淀进行碱处理与等倍量 4硫酸(H2SO4)混合，处理 15min后接种。4胸、腹水、支气管灌洗液标本参照痰标本处理方法。 5脑脊液无菌操作收集的脑脊液，置冰箱或室温 24h，

20、待薄膜形成后将薄膜接种到 LJ 培养基；或将脑脊液在无菌操作环境中 3000rmin 离心30min，取沉淀直接接种到 L-J 培养基。非无菌操作采集的脑脊液标本，离心后的沉淀进行碱处理 与等倍量 4氢氧化钠(NaOH)混合，处理 1015min后接种于酸性 L-J 培养基。 6粪便标本与生理盐水混合后，充分振荡使之成为混悬液；定性滤纸过滤后，滤液经 3000rmin 离心 10min；沉淀进行酸处理与 24 倍量的 4硫酸 (H2SO4)混合，处理 1520min)后接种 L-J 培养基。 7咽喉棉拭子 将棉拭子放入一无菌试管，加入适量生理盐水浸泡，加入等体积 4氢氧化钠(NaOH)后强烈振

21、荡，静置 15min 后接种。 三、接种和培养用吸管取去污染后的标本 01ml，均匀接种在整个培养基斜面，每份标本接种 2 支酸性罗氏培养基。接种后斜面向上于 37环境中平放 24h 后，检查培养基污染情况，拧紧瓶盖，直立放置，37继续培养。 四、结果报告1接种后第 3、7 天各观察 1 次菌落生长情况。发现菌落生长者，经抗酸染色证实后，可报告快速生长分枝杆菌阳性。此后每周观察 1 次，记录菌落生长及污染 情况。阳性生长物经抗酸染色证实后，可报告分枝杆菌生长。满 8 周后未见菌落生长者方可报告培养阴性结果。 2观察时发现非分枝杆菌生长时，应报告污染。培养污染率应在25范围内。污染率过高，提示培

22、养基灭菌不佳，标本前处理、接种等环节有误，应当分析原因，采取相应措施。 3培养结果报告方式 (1)分枝杆菌培养阴性：斜面无菌落生长，以“培养阴性”报告，不可以“一”表示。 (2)分枝杆菌培养阳性(1+)：菌落生长占斜面面积的 14。 (3)分枝杆菌培养阳性(2+)：菌落生长占斜面面积的 12。 (4)分枝杆菌培养阳性(3+)：菌落生长占斜面面积的 34。 (5)分枝杆菌培养阳性(4+)：菌落生长布满整个斜面。 (6)报实际菌落数：菌落生长不足斜面面积 14。 第五节 分枝杆菌快速培养检查分枝杆菌快速培养检查是使用分枝杆菌快速培养仪，通过测定细菌生长代谢检测分枝杆菌生长情况的方法。由于应用营养丰

23、富的液体培养基，并且检测仪能连续监测，故提高了从标本中分离分枝杆菌的敏感性进而缩短报告结果的时间。 为保证检查方法的可靠性，目前分枝杆菌快速培养检查系统除提供相应仪器、试剂以外，均根据不同系统制定了相应的临床标本前处理、接种、检测和报告结果的规程，故在进行相应的检查时，结果的可重复性和可比性均能得到认可。在进行分枝杆菌快速培养检查时，标本接种前的去污染处理，必须严格按照系统说明书中规定的方法进行。孵育检测过程中系统报告阳性时，相应标本的培养液必须首先进行抗酸染色镜检，发现抗酸菌后方可发出阳性报告。 第六节 分枝杆菌药物敏感性测定法一、培养基(一)基础培养基 无淀粉改良罗氏培养基： 谷氨酸钠(纯

24、度 99以上) 72g 磷酸二氢钾(KH2PO4) 24g 硫酸镁(MgSO47H2O) 024g 柠檬酸镁 06g 丙三醇 12ml 蒸馏水 600ml 新鲜全卵液 1000ml 2孔雀绿水溶液 20ml 注：无机盐试剂应达到化学纯(CP)以上等级。 (二)抗结核药物溶液的配制和稀释 1药敏试验用抗结核药物应从厂家取得纯品，并确认纯度和效价，在有效期内使用。 2异烟肼(INH)、利福平(RFP)、氨硫脲(TBl)、乙硫异烟胺(TH)、环丝氨酸(SC)的生物效价按其重量单位计算，计算用药量时只需考虑其纯度。链霉素硫酸盐(SMSO4)、乙胺丁醇盐酸盐(EMBC1)、卡那霉素硫酸盐(KM SO4)

25、、卷曲霉素硫酸盐(CPMSO4)、紫霉素硫酸盐(VMSO4)、对氨水杨酸钠盐 (PAS-Na)等在考虑其纯度的同时，应按生产厂家标定的毫克效价计算其盐型药用量。 3加入培养基中实际药量的计算可参考下列公式： 上述公式中各变量的单位： 实际药量：mg 效价：培养基内药物终浓度：gml 纯度：需制备培养基体积：ml 4绝对浓度法每种药物按表 2-1 制成高浓度药液，再按相应比例稀释成低浓度药液。5比例法按表 2-2 所述浓度制备药物储存液，分装至无菌试管，每管 5 10ml，封口，一 20保存，3 个月内使用。 6除 RFP、TBl、TH 用二甲基甲酰胺溶解，再用灭菌蒸馏水稀释外，其他药物可用灭菌

26、蒸馏水溶解、稀释。 (三)含药培养基制备 1每 100ml 基础培养基加入 1ml 配制、稀释好的抗结核药液，混匀，无菌分装每管 7ml，85凝固 50min。 2制成的培养基 37无菌试验 24h，检查培养基污染情况后置 4避光保存， 1 个月内使用。 二、药敏试验方法(一)绝对浓度法间接法 1菌悬液制备 (1)临床分离分枝杆菌的新鲜培养物(初生长 2 周)无须二次传代即可做药敏试验，初生长 2 周以后和贮存培养物须在改良罗氏培养基上二次传代，取 23周的亚培养物进行试验。 (2)取上述培养物(须刮取斜面各个部分的培养物)置于玻璃磨菌器底部，插入磨菌棒捻动使呈乳酪样，以 05聚山梨醇-80(

27、吐温-80)生理盐水磨菌稀释，与标准麦氏比浊管(MacFarland No1)比浊，即配成 1mgml 的菌悬液。 2接种将 1mgml 的菌悬液 10 倍稀释至 001mgml(10-2mgml)，以灭菌 吸管准确吸取菌液 01m1 分别接种于含药培养基和对照培养基斜面上，每管接种菌量为 1O-3mg。置 37培养，4 周后观察结果。 3结果报告 按下列方式报告对照及含药培养基上菌落生长情况。 (1)分枝杆菌培养阴性：斜面无菌落生长。 (2)分枝杆菌培养阳性(1+)：菌落生长占斜面面积的 14。 (3)分枝杆菌培养阳性(2+)：菌落生长占斜面面积的 12。 (4)分枝杆菌培养阳性(3+)：菌

28、落生长占斜面面积的 34。 (5)分枝杆菌培养阳性(4+)：菌落生长布满整个斜面。 (6)报告菌落数：培养基斜面上菌落数少于 20 个时。 4质量控制 每批试验应以结核分枝杆菌参考菌株(H37Rv 敏感株)10-3mg 检测含药培养基质量。接种 10-3mg 要求对照培养基菌落数在 200 个以上且无融合，若菌落数低于 50 个时，要求重新做药敏试验。 (二)比例法 1茵悬液制备 同绝对浓度法。 2稀释、接种和培养 (1)菌液稀释：静置片刻，使菌液中的颗粒或菌块沉淀后，用刻度吸管或22 号标准接种环将 1mgml 的菌液上清逐步稀释至 001mgml 和01mgml。 22 号接种环 100

29、倍稀释法：用 22 号标准接种环沾取 2 满环 1mgml 的菌液，移至 2ml 灭菌生理盐水中，即稀释成 001mgml 菌液；用同样方法再进行 100 倍稀释，即成 10-4mgml 菌液(注：22 号标准接种环：金属丝直径O7mm，接种环内径 3mm，1 满环移液 001m1)。 微量吸管 10 倍稀释法：用无菌微量刻度吸管吸取 05ml 上述 1mgml菌悬液至 45ml 的灭菌生理盐水可加入 05聚山梨醇-80(吐温一 80)中，即可得到 0.mgml 菌液。按上述方法连续进行 10 倍稀释，可得到001ragml 和 01mg ml 的菌液。 (2)接种：用 22 号标准接种环分别沾取 1 环(即 001m1)001mgml 和 01mgml 的菌液，用划线法均匀接种至对照及含药培养基表面，应注意使菌液尽可能均匀分散于培养基斜面。最终接种菌量为 10-4mg 和 10-6mg。 (3)培养：接种后的培养基置于 37培养，4 周后报告结果。 3结果报告及解释 (1)按以下方式记录菌落生长情况。