1、定量检测几十万个分散的细胞的 DNA 含量应用流式细胞检测技术（FCM）1.收集单细胞悬液(1 106 个)，缓慢加入 1 ml 预冷的 70乙醇，于 4固定过夜，或-20长期固定。2离心收集细胞，再以 1ml PBS 彻底洗去乙醇；3去上清后加入染色液(包含 50ug/ml PI，100ug/ml RNase A，0.2% Triton X-100)，37 染色 30min 后上机检测。4DNA 荧光染料能与 DNA 结合，DNA 含量的多少与荧光染料的结合量成正比，荧光强度反应了 DNA 吸收荧光分子的多少。通过流式检测就能反映细胞内 DNA的含量。看线粒体内外膜结构以及此处的某种蛋白颗粒
2、看线粒体内外膜结构及蛋白颗粒要用透射电镜。定量检测一批光镜切片上含有某种蛋白质的细胞的数目首先对切片上的全部细胞进行针对目的蛋白的荧光探针特异性标记（荧光染色，荧光标记抗体，外源导入荧光蛋白） ，同时对细胞行核复染。再以荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜观察。荧光探针的特异性标记：即荧光强度与特异性标记蛋白的表达量成正相关了解细胞发生死亡时的形态学和某个酶的改变首选以流式细胞术通过对检测细胞以Annexin V/PI 双染法或亚二倍体(Sub-G1)峰的检测分选出凋亡细胞。再荧光标记凋亡细胞的要检查的酶，以激光扫描共聚焦显微镜观察酶的变化。对细胞电子染色后以扫描电子显微镜观察其形态。了解某个新基
3、因所编码的蛋白质的功能1.首选以 Northern blot 检测该蛋白在各组织中的表达。选出表达丰度最高组织细胞。2设立该组织细胞的 cDNA 文库，从中筛选出与该蛋白有相互作用的蛋白（编码基因）。3.以酵母双杂交法及 GSTpulldown 方法对所筛选蛋白做验证。4.由所筛选出的蛋白功能来分析推测该蛋白功能并用分子生化技术及细胞生化技术检测。透射电子 当样品厚度小于 100nm 时，部分电子可穿透样品，将穿透样品的电子叫做透射电子，利用透射电子信息成像的电子显微镜称为透射电镜。二次电子 在入射电子的轰击下，样品表面 550nm 深度激发出来的电子称为二次电子，利用二次电子信息成像的电子显
4、微镜称为扫描电镜。电子显微镜：电子显微镜镜以电子射线作为照明源，以电磁场作为透镜，具有高分辨率和放大倍率的显微镜。电镜用于研究组织和细胞的超微结构。分辨率 表示人眼和光学仪器能够辨别两点之间最小距离的标志。免疫电镜技术 免疫电镜技术是将免疫学方法与电子显微镜技术相结合，利用抗原与抗体特异结合的特性，在超微结构水平定位特异大分子的技术。如果需要了解细胞内部的超微结构变化，请问应选择哪种类型的电镜？TEM透射电镜样本取材时必须做到快、小、轻、冷，为什么？快：1 分钟内固定，尽可能保持其生活状态，因为瞬间的拖延都会导致细胞超微结构的变化。 小： 约 1mm的小块，组织块过大其中央得不到及时固定会发生
5、细胞自溶现象。轻： 不要牵拉、锯、挤压组织，避免细胞受到损伤。冷： 低温操作，4保存，降低酶的活性，避免组织发生自溶。没有及时固定的组织细胞透射电镜下会出现何种改变？ 自溶扫描电镜取材必须注意哪些？因为扫描电镜观察的是样品表面结构，必须充分暴露并保护好观察面，避免损伤要观察的部位，材料要新鲜，取材部位要准确，样品块要尽量小一些，用锋利的刀片，尽快固定。气管、胃、肠粘膜可固定在滤纸上展平，要将表面的血液、粘液用生理盐水或缓冲液仔细漂洗干净。贴壁细胞: 进口玻璃盖玻片 1cm1cm ，生长细胞，缓冲液漂洗，戊二醛固定 12 小时游离细胞： 玻璃盖玻片表面涂 10%多聚赖氨酸（10 分 钟） ，未完
6、全干燥时涂一层细胞（10 分钟） ，戊二醛固定 12 小时简述激光共聚焦显微镜的工作原理。在显微镜基础上配置激光光源、扫描装置、共轭聚焦装置和检测系统而形成的新型荧光显微镜系统。以激光作为激发光源，对样本进行断层扫描，同时采用光源针孔与检测针孔共轭聚焦技术，最终获得高分辨率光学切片图像的荧光显微镜系统。简述激光共焦显微镜与荧光显微镜的差别。它有哪些优缺点？光源不同（激光 Vs 普通光） ，扫描方式不同（断层扫描 VS 一次成像） ，聚焦不同（光源针孔+检测针孔双聚焦 VS 透镜聚焦） ，图像采集处理不同（计算机采集处理 VS 目视）优点：高水平及垂直分辨率，可经计算机处理成三维结构，缺点：1.
7、逐点扫描，成像速度慢。2.观测厚度：50-100m3.分辨率极限：0.15m简述激光共聚焦显微镜的功能。观察标记荧光素的样品：1.薄层断层扫描 2.多通道同时成像 3.ZOOM 成像 4.多维度成像 5.荧光定量分析负显性突变：对影响蛋白质功能的关键位点进行突变，所得突变体不仅丧失了原有功能，并且可以抑制内源性蛋白质的功能。DNA microarray：是一种用于分子生物学和医学领域的高通量技术. 它由一系列成千上万个精微的 DNA 寡核苷酸点排列而成，这些 DNA 寡核苷酸含有百亿分之一摩尔特定序列的。它们或者是一小截基因，或者是 DNA 的其他成分。它们被作为探针，在非常严格的条件下和一个
8、叫做靶分子的 cDNA 或 cRNA 样本杂交。由于靶分子带有荧光标记，因此通过探针-靶分子的杂交，并根据杂交后荧光的有或无 ，强或弱，对靶分子中特定核酸序列的丰度进行检测。共激活因子：是一种蛋白，本身不能与 DNA 结合，但能够通过与具有 DNA 结合结构域的激活因子（或转录因子）结合来增强基因的表达。共激活因子可调节转录的许多其他过程，如转录的延长、终止、 RNA 剪接以及激活因子和共激活因子复合体的降解等。报告基因: 是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列
9、控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控。 si RNA(small interfering RNA)：也被称为短干扰 RNA(short interfering RNA)或沉默 RNA(silencing RNA)，通常为人工合成的长约 20 到 25 个核苷酸的双股 RNA，利用其可与特定信使 RNA（mRNA）发生同源性结合并使之降解的特点，诱导序列特异的目标基因发生沉默，从而阻断特定基因的表达。具有靶向、高效、易于操作的特点，是一种研究细胞内基因表达的新技术。染色质免疫沉淀技术（CHIP）: 研究体内 DNA 与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定
10、蛋白质DNA 复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的 DNA 片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与 DNA 相互作用的信息。凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA）:是一种研究核酸结合蛋白和其相关的核酸结合序列相互作用的技术。通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和 32P 同位素标记的 DNA 或 RNA 探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。DNA-蛋白复合物或 RNA-蛋白复合物比非结合的探针移动得慢。在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。同位素标记的
11、探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或单链。检测可用纯化蛋白、部分纯化蛋白或核细胞抽提液。研究蛋白质在细胞内的活动情况需要从哪些方面入手？由以下几个方面决定：合成速率：mRNA 水平。 稳定性：蛋白水平。定位：细胞核、细胞质、细胞器。活性：酶活性：激酶、NADPH 氧化酶、组蛋白脱乙酰酶（HDAC）等转录活性：主要指转录因子(TF)，促进靶基因转录的活性（注意：转录因子活性受到 co-activator 或 co-repressor 的调节）和哪些蛋白在一起相互作用、相互影响？通常有哪些实验手段可以用来研究蛋白和 DNA 的相互作用？体内 ：染色质免疫沉淀技术（CHIP） 。体外：凝胶电泳迁移
12、率改变分析（EMSA）可用哪些技术对细胞内某个蛋白的水平进行干预? 它们有什么区别?增减合成该蛋白的必需氨基酸，促进或抑制编码该蛋白的 DNA 转录SiRNA 对编码该蛋白的 RNA 沉默。免疫细胞化学技术：是利用免疫化学反应来定位组织细胞中特异大分子的一类技术。原位杂交技术：将分子生物学与细胞化学技术结合起来，以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位，与细胞内需探测的核酸杂交以检测特异核酸分子的技术，可以反映特异核酸分子的量，同时也可以反映与组织、细胞、细胞器或染色体结构的位置关系。第二抗体：能够识别一抗的种属特异性，并因此结合一抗，称为二抗（抗种属抗体）原位杂交技术严格度：也叫严紧度。决定探
13、针是否与含不相配碱基的核酸序列结合的条件，是决定杂交双链间形成氢键稳定性的条件，从而最终影响特异性。简述免疫荧光技术和免疫亲和技术的比较。免疫荧光技术将荧光素作为标记物使组织细胞中形成的抗原抗体复合物在荧光显微镜下可见，从而显示抗原物质的定位。亲和细胞化学技术是利用亲和物质之间高度亲和能力而互相结合，以定位特异分子的技术。（亲和物质 具有多价能力的物质，与另一种亲和物质有高度亲和力，又能与抗体、蛋白质及各种标记物(荧光素、酶、胶体金等)结合）亲和技术优点：灵敏度高，特异性强，稳定性好。根据标记物的不同可用荧光显微镜，光镜，电镜等多种观察方法.如何在培养细胞水平或临床标本上了解新发现蛋白质的定位
14、？如需了解蛋白质定位和定量的信息，可综合采用哪些技术？（分子生物学和细胞生物学）免疫组织化学，免疫细胞化学，免疫荧光技术，免疫胶体金技术，免疫酶技术，免疫亲和技术以免疫酶技术为例，简述操作流程。 （“流程”的意思）. 免疫酶技术是将酶作为标记物将组织细胞中形成的抗原抗体复合物得到标记，再通过酶细胞化学反应产生显微镜下可见的显色物质，间接显示抗原物质的定位。流程：组织细胞固定石蜡包埋或冷冻切片（保持原位）-化学反应显色反应观察如何应用免疫荧光技术分析 2 种蛋白质的共定位，简述原理和操作流程。免疫荧光技术将荧光素作为标记物使组织细胞中形成的抗原抗体复合物在荧光显微镜下可见，从而显示抗原物质的定位
15、。基本过程：固定（组织脱水，包埋、切片）-免疫细胞化学反应，抗原与抗体标记系统反应。原位杂交技术中如何应用了其他几种细胞化学技术？基本实验过程：使含有特异序列、经过标记的核酸单链即探针，在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链即靶核酸发生杂交,再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细胞原位显示特异的 DNA 或 RNA 分子。探针标记纯化(变性) 涂覆乳胶 放射自显影 原位杂交杂交体探测：加酶联抗体加酶底物显色 金银染色 样品制备切片通透处理1）同位素标记探针放射自显影2）加入底物四唑氮蓝和吲哚酚酶细胞化学技术3）核酸探针杂交分子生物学技术4）地高辛抗体与探针结合免疫细胞化学
16、技术为什么说原位杂交技术是分子生物学和细胞化学技术的结合？原位杂交技术中，先将标记的核酸探针与组织细胞中靶核酸分子结合形成杂交体，这是分子生物学技术，然后用同位素或免疫细胞化学技术探测杂交体。如 用地高辛标记核酸探针，杂交后用碱性磷酸酶联结的小鼠抗地高辛抗体与探针结合，这里应用的是免疫细胞化学技术。为了使酶可见，再加入其底物四唑氮蓝和吲哚酚，最终形成蓝紫色物质，这就是酶细胞化学技术。这样，通过酶细胞化学最终产生蓝紫色物质，间接探测了酶的定位，又通过酶联抗体与探针的免疫组化反应，间接探测了探针，进而间接探测了靶核酸的定位。流式细胞术流式细胞术是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞
17、（或生物学颗粒）的理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。一般可分为三个部分：1.细胞流动室及其液流驱动系统 2.激发光源及其光束形成系统 3.细胞信号检测与分析、显示、记录系统。散射光信号：前向散射光 FSC：细胞前向小角度散射光信号，反映被测细胞的体积大小和活力。可用以设阈排除样品中的细胞碎片，设门排除细胸团块。侧向散射光 SSC：细胞 90 度侧向散射光信号，信号强度反映细胞内部颗粒度和精细结构的变化。实际工作中常用于外周血样品区分中性粒细胞与其他白细胞。层流：当液体在管道中稳定流动时是以管道的轴心为中心分层流动的，中心轴处液流速度最快，从中心轴向外流速逐层减低。根据柏努利定律液流速度大
18、的地方压强低，液流速度小的地方压强高，所以层流能保证样品中的每一细胞都沿流动室的中心轴运动。鞘流技术：根据层流原理发展起来的技术，可以实现两种液体的同轴流动，样本细胞流位于轴心稳定流动，外面包裹有鞘液(sheath)。流体动力学聚焦：稳定的液流从截面积较大的部分流入截面积较小的部分后，有一个聚焦收缩作用，细胞流直径被约束在 10-20um，避免了多个细胞重叠进入检测区。细胞自发荧光。细胞内物质自身也发出荧光，能被 FCM 灵敏的检测到，这种未染色的细胞自身发出的一些荧光称为自发荧光。荧光光谱重叠现象：当细胞携带两种以上荧光素激发出不同波长荧光时，理论上可选择滤光片使每种荧光仅被相应的通道检测到
19、。但由于目前使用的各种荧光染料都是宽发射谱性质，虽然它们之间各自发射的峰值各不相同，但发射谱范围有一定的重叠，因而少量的荧光信号会被另一通道检测到，这种现象就是光谱重叠荧光补偿：目前使用的荧光素都是宽发射谱的，相互之间有明显的重叠部分。利用电子技术或计算机软件等方法将串入相邻荧光通道的信号加以扣除，这种技术称为荧光补偿。新鲜实体组织的单细胞悬液样本制备：酶消化法、机械法、化学试剂处理法三种方法比较：机械法往往造成严重的细胞损伤，而结果却是较低的细胞产量。酶消化法、化学试剂处理法对实体组织的分散效果较理想，但会造成所测化学成分的不良影响。石腊包埋组织单细胞制备：切片-脱脂-水化-消化-终止消化-
20、过滤-收集-70%酒精固定。FCM 测量数据的存贮、显示和分析存贮：List Mode 方式，用表格的方式将每一个被测细胞的众多原始测量数据全部记录下来，成为一个数据文件。显示：统计分布直方图：表示的是一个测量参数与细胞数量间的分布关系。二维散点图：X 轴代表第一个测量参数，Y 轴代表第二个测量参数。每个点代表一个细胞。荧光细胞化学的评价标准1荧光细胞化学的特异性。 （FCM 的荧光细胞化学过程要求有足够的特异性，即所用荧光染料与所感兴趣的细胞成分是否为特异性结合）2.荧光细胞化学的化学定量关系：在相同的条件下，荧光反应产物的量（荧光强度）与所研究的生化成份的含量或活性之间有严格的化学定量关系
21、。亚二倍体细胞峰（Sub-G）凋亡细胞核小体崩解，DNA 含量减少，加之由于 DNA 的降解，与荧光染料的结合减少，因此 DNA 染料的着色能力下降，荧光强度降低，表现在 FCM 测得的细胞核 DNA 含量分布曲线中，在 G1 峰左边的低道数出现一个 DNA 含量低于 G1 细胞的分布峰，亚二倍体峰，即亚 G1 峰(凋亡峰)。Annexin-V/PI 双染色法：细胞早期凋亡时，膜内 PS 外翻，可被 Annexin-V/FITC 识别（绿荧光） ，中期膜通透性增加时，PI 可进入胞内对 DNA 染色（红荧光） ，晚期膜破碎，只有红染的细胞核。DNA 指数（DI）：描述样品细胞的 DNA 含量的偏离程度和倍体水平。正常二倍体细胞 DI=1.0，被测样品细胞 DI=被测样品中 G0/G1 细胞 DNA 含量/正常二倍体细胞的 DNA 含量。1：亚二倍体，2：四倍体。增殖指数（PI）：PI 用来反映肿瘤细胞的增殖能力。PI 定义为样品细胞群体中S 期细胞和 G2/M 细胞之和占总细胞群体的百分比。
