1、学科分类号本科生毕业论文题目中文考马斯亮蓝法、银染法测定蛋白质纯度的对比研究（英文）COOMASSIEBRILLIANTBLUEANDSILVERSTAININGMETHODTODETERMINETHEPROTEINPURITYOFCONTRASTRESEARCH学生姓名学号1011402014系别化学化工系专业制药工程指导教师讲师起止日期2013092014052014年5月26日怀化学院本科毕业论文设计诚信声明作者郑重声明所呈交的本科毕业论文设计，是在指导老师的指导下，独立进行研究所取得的成果，成果不存在知识产权争议。除文中已经注明引用的内容外，论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的
2、成果。对论文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确的方式标明。本声明的法律结果由作者承担。本科毕业论文（设计）作者签名2014年05月26日I目录摘要II关键字IIABSTRACTIIKEYWORDSII1前言111蛋白质、蛋白质纯度的简介1111蛋白质的概述1112蛋白质纯度的概述1113蛋白质纯度测定的方法212考马斯亮蓝法的概述213银染法的概述314凝胶上蛋白染色进展52实验部分521仪器与试剂522溶液的配制523实验步骤8231安装电泳模具9232凝胶配制92321凝胶配方92322分离胶配制10233浓缩胶配制10234样品处理10235上样10236染色112361考马
3、斯亮蓝染色法112362银染法11237扫描凝胶11238清场1124实验方法11241两种染色法常规检验操作11242两种染色法上样量相同12243两种染色法的最低检查限12244两种染色法的线性关系123结果与讨论1231两种染色法常规检验操作分析1232两种染色法上样量相同的结果对比1433两种染色法的检查限的探索154结论18参考文献19致谢20II考马斯亮蓝法、银染法测定蛋白质纯度的对比研究摘要采用SDSPAEG（十二磺基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）的方法，对考马斯亮蓝法和银染法测定蛋白质纯度进行对比研究。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法的分离原理，是依据大多数蛋白质能与阴离子表面活性剂十二
4、烷基磺酸钠（SDS）按重量比结合成复合物，使蛋白分子所带的负电荷远远超过天然蛋白质的净电荷，消除了蛋白质分子的电荷效应，以SDS聚丙烯酰胺凝胶为支持物，利用电荷效应、浓缩效应和分子筛效应来分离蛋白质1。其电泳迁移率仅反映蛋白质分子的大小。非还原型用于测蛋白质纯度。还原型是指在样品处理时加入还原剂，使蛋白分子去折叠，用于测定分子量。比较SDS聚丙烯酞胺凝胶电泳SDSPAGE中蛋白染色的2种方法。方法将SDSPAGE中的蛋白分别用银染、考马斯亮蓝染色2。关键字SDS聚丙烯酰胺凝胶、电泳、蛋白质纯度、考马斯亮蓝法、银染法IISTUDIESONTHEINTERACTIONBETWEENSINOMENI
5、NEANDDNABYSPECTROSCOPYABSTRACTUSINGSDSPAEG12SULFOSODIUMSULFATE,POLYACRYLAMIDEGELELECTROPHORESISMETHOD,THECOOMASSIEBRILLIANTBLUEANDSILVERSTAININGMETHODTODETERMINETHEPROTEINPURITYSEPARATIONPRINCIPLEOFSDSPOLYACRYLAMIDEGELELECTROPHORESISMETHOD,ISBASEDONMOSTPROTEINSWITHANIONICSURFACTANTSODIUMDODECYLSULFA
6、TESDSBYWEIGHTTHANCOMBINEDINTOCOMPLEX,THEPROTEINMOLECULESWITHTHENEGATIVECHARGEISMUCHHIGHERTHANTHENETCHARGEOFNATURALPROTEIN,ELIMINATESTHEPROTEINMOLECULECHARGEEFFECT,WITHSDSPOLYACRYLAMIDEGELASSUPPORT,USEOFCHARGEEFFECTANDCONCENTRATIONEFFECTANDTHEEFFECTOFTHEMOLECULARSIEVETOSEPARATEPROTEINS1THEELECTROPHOR
7、ETICMOBILITYOFONLYREFLECTTHESIZEOFTHEPROTEINMOLECULESNOTREDUCEDTOMEASUREPROTEINPURITYREDUCEDREFERSTOTHESAMPLEPROCESSING,REDUCINGAGENTISADDEDIN,THEPROTEINMOLECULESTOFOLD,USEDFORTHEDETERMINATIONOFMOLECULARWEIGHTCOMPARESDSPOLYPROPYLENEPHTHALICAMIDEGELELECTROPHORESISSDSPAGEOFTHETWOMETHODSOFPROTEINSTAINI
8、NGMETHODSINTHESDSPAGEPROTEINDYEDWITHSILVERANDCOOMASSIEBRILLIANTBLUESTAINING,RESPECTIVELY2KEYWORDSSDSPOLYACRYLAMIDEGEL、ELECTROPHORESIS、PROTEINPURITY、COOMASSIEBRILLIANTBLUEANDARGENTATIONMETHOD11前言11蛋白质、蛋白质纯度的简介111蛋白质的概述蛋白质是由氨基酸以“脱水缩合”的方式组成的多肽链经过盘曲折叠形成的具有一定空间结构的物质。蛋白质是由氨基酸按一定顺序结合形成一条多肽链，再由一条或一条以上的多肽链按照
9、其特定方式结合而成的高分子化合物。蛋白质就是构成人体组织器官的支架和主要物质，在人体生命活动中，起着重要作用，可以说没有蛋白质就没有生命活动的存在。蛋白质是一种复杂的有机化合物，旧称“朊（RUN”。氨基酸是组成蛋白质的基本单位，氨基酸通过脱水缩合连成肽链。蛋白质是由一条或多条多肽链组成的生物大分子，每一条多肽链有二十至数百个氨基酸残基（R）不等；各种氨基酸残基按一定的顺序排列。蛋白质的氨基酸序列是由对应基因所编码。除了遗传密码所编码的20种基本氨基酸，在蛋白质中，某些氨基酸残基还可以被翻译后修饰而发生化学结构的变化，从而对蛋白质进行激活或调控。多个蛋白质可以一起，往往是通过结合在一起形成稳定的
10、蛋白质复合物，折叠或螺旋构成一定的空间结构，从而发挥某一特定功能。合成多肽的细胞器是细胞质中糙面型内质网上的核糖体。蛋白质的不同在于其氨基酸的种类，数目，排列顺序和肽链空间结构的不同。112蛋白质纯度的概述2一般药品用，或者试剂用的蛋白质都有纯度标识。因为一般合成的蛋白质里都有杂质，杂质越少，纯度越高。蛋白质纯度高不仅意味着样品里没有别的种类的蛋白质，也意味着没有目标蛋白的降解产物（例如被蛋白酶切过的）以及没有目标蛋白的错误折叠（以至形成沉淀）和错误的二硫键。113蛋白质纯度测定的方法凝胶电泳是分离蛋白质的一种强有力的生化分析工具。而蛋白质染色在凝胶电泳系统中则是一个重要的组成部分，随着蛋白质
11、组学的飞速发展，凝胶蛋白质染色技术已成为衔接二维电泳和下游质谱分析的关键环节。目前，常用的凝胶上蛋自质染色方法主要有染料染色法、银染法、负染法和荧光染色法3。12考马斯亮蓝法的概述考马斯亮蓝具有成本低、操作便捷及质谱兼容性好等特点，使得该类染料成为最常用的蛋白质染色染料4。考马斯染料最初是应用于纺织工业中羊毛的染色，FAZEKAS等在1963年首次将考马斯亮蓝R250应用于聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移到醋酸纤维素膜上蛋白质的染色，取得了较好的效果。随即，考马斯亮蓝R250和它的二甲基化衍生物考马斯亮蓝G250又被应用于聚丙烯酰胺凝胶上的蛋自质染色。在接下来的20多年中，不断有研究者针对蛋白质的
12、考马斯亮蓝染色方法进行优化，各项技术指标如灵敏度、染色时间和凝胶背景都有一定程度的改善，但总体染色灵敏度还是较低，约为几百纳克到几微克，染色时间较长，且凝胶背景偏深。NEUHOFF等开发的胶体3考马斯亮蓝染色法，使考马斯亮蓝在染色液中形成胶束，从而有效提高了染色灵敏度，降低了凝胶背景，是考马斯亮蓝染色法优化史上具有重大意义的改进，通过该方法得到的染色灵敏度可以和银染相媲美。CANDIANO等发明的“BLUESILVER“考马斯亮蓝染色法是该类染色法中的又一大进步，其灵敏度可达2NG/BAND。PINK等在前人研究的基础上，最近开发出了一种高灵敏和质谱兼容性好的新型考马斯亮蓝染色法，通过改变染色
13、液中磷酸的浓度，使得灵敏度达到2NG/BAND，同时质谱兼容性也得到了很大提高。虽然考马斯亮蓝蛋白质染色的原理尚未完全确定，但其可能机理主要为考马斯亮蓝是二磺酸化的三苯甲烷类染料，其可通过染料的磺酸基和蛋白质上质子化的碱性氨基酸间以静电力相结合。其次，还可通过染料的疏水性残基和蛋白质的疏水性区域的作用产生疏水性力，同时也存在氢键和范德华力的作用5。13银染法的概述银染法主要是通过银离子渗透进入凝胶内与蛋白质结合，再用还原剂将与蛋白质相结合的银离子还原为金属银，从而达到检测蛋白质的目的。银染法的原理如下在溶液条件下银离子能与蛋白质的天冬氨酸和谷氨酸上的羧基通过静电力相结合；同时银离子还可与组氨酸
14、、半肌氨酸、蛋氨酸和赖氨酸上的咪唑、筑基、甲硫基和氨基结合。而与蛋白质结合的银离子可在甲醛等还原剂的还原作用下变为黑褐色的金属银，使蛋白质显色6。热力学研究表明胶表而结合或残留的银离子比与蛋白质结合的银离子更容易被还原为金属银，造成凝胶上4蛋白质的负染现象，但一般在凝胶显影之前会有水洗步骤，可将胶而上未与蛋白质结合的银离子尽可能的洗脱掉。因此，蛋白质银染的重现性和背景的深浅很大程度上取决于显影前的水洗步骤，如水洗时间过长会使银染灵敏度低，水洗时间小足会造成凝胶背景加深。根据银染时，溶液条件的不同，蛋白质银染法可分为酸性银染法和碱性银染法（即银氨法），酸性银染法通常是将中性硝酸银水溶液染色后的凝
15、胶放在含甲醛的强碱性碳酸盐类显影液中显影，而碱性银染法一般是指将凝胶放在银氨溶液染色接着用含甲醛的柠檬酸液显影。这两种银染法各有优缺点，如酸性银染法比碱性银染法操作相对简单，但灵敏度没有碱性银染法高。虽然在所有染色方法中，银染法的灵敏度是最高的，但其缺点也很明显，如耗时长、步骤繁多、线性范围小和质谱兼容性差等。围绕银染法的小足，科研工作者对该方法进行了不断的改进，尤其是如何改进蛋白质银染法的质谱兼容性已成为当前研究的热点。银染中醛类还原剂能与蛋白质以共价键结合，使蛋白质甲基化，造成蛋白质下游研究的质谱兼容性降低4。SHEVCHENKO等用醇和酸的溶液代替以往醛类对蛋白质进行固定，虽然灵敏度有一
16、定的降低，但蛋白质经银染后的质谱兼容性得到了提高。JIN等YZ,IA首先采用染料离子如钙红指示剂和铬黑T作为银染增敏剂，以减少显影液里甲醛的用量，使得蛋白质鉴定时质谱兼容性得到大幅提高。CHEVALLET等发明的用还原糖代替甲醛的银染方法也取得了较好的灵敏度与质谱兼容性。JIN等还在前人研究基础上创建了EZ银染双重染色法，即用阴阳染料离子对完成第一步染料染色，灵敏度285NG/BAND，根据实验需要选择性地进一步进行银染，灵敏度可达00502NG/BAND，为目前最灵敏的蛋白质银染法。由于染料分子中含偶氮键，在银离子还原中可起到增敏的作用，因此降低了甲醛的使用量，增加了银染法的质谱兼容性7。1
17、4凝胶上蛋白染色进展目前围绕染色方法的改进主要集中在如何提高染色灵敏度，操作是否简捷，成本是否低廉及操作是否全等方面。上述各类方法经几十年的发展虽都取得了一定的进展，但还是存在许多小足之处有待于改进。例如染料染色法虽操作简单，质谱兼容性良好，但灵敏度还需提高；银染法仍然是目前最灵敏的染色方法，但其质谱兼容性差和操作步骤繁琐的问题有待改善；荧光染色法灵敏度介于银染和染料染色法之间，虽在蛋白质组学研究中具有较大的优势，但寻找更加稳定、灵敏、安全的荧光染料，缩短操作时间仍是荧光染色法所需要解决的问题；负染法可以较好地克服上述诸多缺点，但其主要缺点是对比度有待提高。以上几点将成为未来几年内染色方法学需
18、要解决的问题，这些方而问题的顺利解决，将会对蛋白质染色方法的进展产生重大影响8。2实验部分21仪器与试剂表21仪器及设备仪器名称生产厂家6垂直电泳仪安玛西亚影像摄录系统安玛西亚电陶炉LCE0135忠臣电器有限公司漩涡仪WH861太仓市科教器材厂脱色摇床SKR330PRO美国赛洛捷克电泳玻璃板B20RAD电泳梳子B20RAD表22试剂及药品药品名称分子量级别产地蛋白分子量MARKER250KDATHERMOSCIENTIFIC银染试剂盒GRINVITROGEO甲醇3204AR北京化工厂冰醋酸6005AR北京化工厂过硫酸铵228201AR北京化工厂十二烷基硫酸钠27238ARAMRESCO三羟甲基
19、氨基甲烷12114BRAMRESCO丙烯酰胺710779ARMPBIOMEDICALS甲叉双丙烯酰胺15417ARAMRESCO7盐酸3646095AR北京化工厂甘油920938CP北京化工厂溴酚蓝66997BS天津市光复精细化工研究所甘氨酸7507AR安玛西亚甲基乙二胺920938ARAMRESCO22溶液的配制（1）15MOL/L三羟甲基氨基甲烷盐酸（TRISHCL,PH88）用精密度为001的电子天平称取1815GTRIS，至100ML烧杯中，加入适量超纯水搅拌使溶解；用滴管滴加浓盐酸调PH至88，将溶液移至100ML量筒中，加超纯水定容至100ML，再移至容量瓶中28保存。（2）05M
20、OL/L三羟甲基氨基甲烷盐酸（TRISHCL,PH68）用精密度为001的电子天平称取605GTRIS于250ML烧杯中，加入适量超纯水搅拌使溶解；用滴管滴加浓盐酸调PH至68，将溶液移至100ML量筒中，加超纯水定容至100ML，再移至容量瓶中28保存。（3）30丙烯酰胺08N,N甲叉双丙烯酰胺用精密度为001G的电子天平分别称取30G的丙烯酰胺，08GN,N甲叉双丙烯酰胺，至100ML烧杯中，加入适量超纯水搅拌使完全溶解，将溶液移至100ML量筒中，加超纯水定容至100ML，用滤纸过滤，再移至容量瓶中28避光保存。（4）1十二烷基磺酸钠SDS用精密度为001G的电子天平分别称取1G十二烷基
21、磺酸钠于100ML烧杯中，加入适量超纯水搅拌使完全溶8解，将溶液移至100ML量筒中，加超纯水定容至100ML，再移至容量瓶中室温保存。（5）10四甲基乙二胺用1ML刻度移液管量取1ML四甲基乙二胺，至10ML小烧杯中，用10ML刻度移液管加超纯水9ML，混匀，分装至EP管中，20保存。（6）10过硫酸铵用精密度为001G的电子天平称取100MG过硫酸铵，于10ML小烧杯中，用1ML刻度移液管加1ML超纯水使溶解，现配现用。（7）5电极缓冲液TRIS甘氨酸缓冲液，PH83用精密度为001G的电子天平分别称取755GTRIS，47G甘氨酸于500ML烧杯中，加入适量超纯水搅拌使完全溶解，用25M
22、L量筒加入10SDS25ML，混匀后将溶液移至500ML量筒中，加超纯水定容至500ML，再移至容量瓶中28保存。（8）样品缓冲液4电极缓冲液用精密度为000001G的分析天平分别称取0303GTRIS、08GSDS、2MG溴酚蓝至25ML烧杯中，用移液器取0189ML盐酸加入，用5ML刻度吸管量取4ML甘氨酸加入，加入适量超纯水搅拌使完全溶解，将溶液移至10ML量筒中，加超纯水定容至10ML。（9）考马斯亮蓝法用染色液用精密度为001G的电子天平称取1G考马斯亮蓝R250于500ML烧杯中，分别用250ML量筒量取200ML甲醇，用50ML量筒量取50ML冰醋酸至上述烧杯，加入适量超纯水搅拌
23、使完全溶解，将溶液移至500ML量筒中，加超纯水定容至500ML，再移至容量瓶中常温保存。9（10）考马斯亮蓝法用脱色液在1000ML量筒中倾入甲醇400ML，用100ML量筒量取冰醋酸100ML加入，加超纯水定容至1000ML，再移至容量瓶中常温保存。（11）银染法用试剂见试剂盒。固定液甲醇50ML、超纯水45ML、乙酸10ML致敏液甲醇50ML、超纯水505ML、致敏液5ML染色液染色液A5ML、染色液B5ML、超纯水45ML显影液显影液5ML、超纯水45ML终止液终止液5ML23实验步骤231安装电泳模具安装玻板、边条，并拧紧螺丝，夹好使模具固定。232凝胶配制成分分离胶（15）浓缩胶（
24、45）分离胶（14）浓缩胶（45）15MOL/LTRISHCL,PH883ML0ML375ML0ML05MOL/LTRISHCL,PH680ML15ML0ML15ML30丙烯酰胺08N,N甲叉双丙烯酰胺6ML09ML7005ML09ML1SDS12ML06ML15ML06ML102321凝胶配方2322分离胶配制取25ML洁净的烧杯，按表2331凝胶配方配制分离胶。将配好的分离胶混匀，迅速在两玻璃板间隙中灌注，灌至距小玻板2CM的位置，在胶液上轻轻覆盖超纯水，室温聚合。233浓缩胶配制另取25ML洁净的烧杯，按表2331凝胶配方配制浓缩胶，当分离胶和水层之间出现明显的界限时，表明聚合完毕，倾去
25、上面水层，用滤纸吸干，再灌入配好的浓缩胶，插入样品梳，注意避免气泡出现，室温聚合。234样品处理根据待检样品蛋白质浓度及加样量应不低于5UG（银染法）或10UG（考马斯亮蓝法）的原则，选择相应的样品缓冲液，检测原液按31的比例加4样品缓冲液，100水浴5分钟。235上样浓缩胶聚合完毕，参照垂直电泳仪SOP，小心移去加样梳，在上槽中加入电极缓冲液，将处理好的样品和标准品按顺序加样。做好记录，避免混淆。银染法上样5UG以上，考马斯亮蓝法上样10UG以上，标准品上样量为10UL以上。超纯水171ML288ML25351ML288ML10四甲基乙二胺60UL40UL60UL60UL10过硫酸铵55UL
26、35UL60UL60UL11将电泳槽与电源连接，在浓缩胶中恒流10MA，在分离胶中恒流18MA进行电泳。当溴酚蓝前沿恰好跑至分离胶底部，停止电泳，关闭电源。236染色从电泳槽上取下玻板，用刮勺撬开玻板，取下凝胶，置一大培养皿内，进行染色。2361考马斯亮蓝染色法将电泳后的凝胶取下，浸入染色液中，室温浸泡46小时过夜。然后浸入脱色液中将凝胶放于脱色摇床上脱色，直至凝胶底色近于无色为止，凝胶保存在纯化水中。2362银染法凝胶固定液中浸泡20MIN致敏液浸泡20MIN/次（两次）水洗2次（10MIN/次）染色液中浸泡30MIN水洗23次（10MIN/次）显影液中浸泡315MIN滴加终止液。237扫描
27、凝胶打开电源，参照IMAGEMASTERVDS影像分析系统SOP将凝胶进行扫描，由软件分析结果。238清场将电泳仪和凝胶扫描仪按仪器标准操作程序清洁收好；将电泳板及量具、其他器皿洗刷清洁，清洁台面和地面。24实验方法241两种染色法常规检验操作12在相同实验条件下，按照标准操作规程，考马斯亮蓝法和银染法均按正常实验检验操作流程。取同一样品原液（MOL/L），上样量按SOP中考马斯亮蓝法不低于10UG、银染法不低于5UG计算9。242两种染色法上样量相同在相同实验条件下，按照标准操作规程，考马斯亮蓝法和银染法上样量相同的情况10。由于两种染色法所使用凝胶厚度不同，即考马斯亮蓝法无法达到银染法规定
28、的上样量50UL。因此，取同一样品原液（MOL/L），考马斯亮蓝法时将原液稀释，使两种染色法上样浓度保持一致11。243两种染色法的最低检查限在相同实验条件下，按照标准操作规程，考马斯亮蓝法和银染法的最低检查限的检测采用梯度浓度上样的方法来测定两种染色法的最低检查限12。244两种染色法的线性关系在相同实验条件下，按照标准操作规程，考马斯亮蓝法和银染法的相关系数的探索随意取几组上样浓度，通过实验来鉴定两种染色法的线性相关度13。3结果与讨论31两种染色法常规检验操作分析取三组不同浓度的原液，分别为SYY201311042286MG/ML、SYY201311052275MG/ML、SYY2013
29、12062448MG/ML。对这三组原液分别进行考马斯亮蓝法和银染法进行蛋白质纯度的测定，根据SOP中上样13浓度的限制规定，可计算出考马斯亮蓝法的上样量是6UL、6UL、6UL；银染法的上样量均为50UL。由于两种染色方法的灵敏度不同，可以看出显现出来杂带数量的情况也不同。说明两种染色法在测蛋白纯度时，表现出来的结果是有所差异的。原液SYY201311042286MG/ML原液SYY201311052275MG/ML14原液SYY201312062448MG/ML32两种染色法上样量相同的结果对比取同浓度的原液SYY201311052275MG/ML，对这组原液分别进行考马斯亮蓝法和银染法进
30、行蛋白质纯度的测定，根据SOP中上样浓度的限制规定，可计算出考马斯亮蓝法的上样量是6UL；银染法的上样量均为50UL。由于两种染色方法的灵敏度不同，可以看出显现出来杂带数量的情况也不同。说明两种染色法在测蛋白纯度时，表现出来的结果是有所差异的。15原液SYY201311052275MG/ML33两种染色法的检查限的探索取同浓度的原液YY201312291042MG/ML，对这组原液分别进行考马斯亮蓝法和银染法进行蛋白质纯度的测定，将原液稀释成不同的浓度来测定两种染色法的最低检查限。由于两种染色方法的灵敏度不同，可以看出显现主带的浓度不同。说明两种染色法在测蛋白纯度时的最低检查限存在差异。考马斯
31、亮蓝法的检查限浓度约为0015002MG/ML，银染法的检查限浓度约为00002000025MG/ML。1634两种染色法的线性关系研究以原液浓度为上样梯度对蛋白质含量作图，结果见下图所示。可见，考马斯亮蓝法标准曲线比银染法标准曲线的线性明显要好。线性好则代表浓度与条带之间有很好的关联，所以考马斯亮蓝法可以用来定量,根据条带深浅确定条带代表的蛋白含量的多少；银染法则不能。因此银染法在测定时需要做对照品，而考马斯亮蓝法不用。17的BAND（考染）MWBAND（银染）MW3841400199882626267877622891331，5641243670182184结论（1）无论上样量相同或是上样
32、量不同，都说明银染法的灵敏度比考马斯亮蓝法高。考马斯亮蓝染色法虽操作简单，质谱兼容性良好，但灵敏度还需提高；银染法是目前最灵敏的染色方法，但其质谱兼容性差和操作步骤繁琐的问题有待改善。（2）考马斯亮蓝法的检查限浓度约为0015002MG/ML，银染法的检查限浓度约为00002000025MG/ML。银染法的灵敏度比考马斯亮蓝法高出约80100倍。（3）考马斯亮蓝法的相关系数09939银染法的相关系数09012。线性的优劣代表浓度与条带深浅之间的关联度，考马斯亮蓝可以用来进行定量分析，根据条带的深浅可以确定条带代表的蛋白质含量的多少，从而可以直接通过扫描获取蛋白纯度；而银染法则不行，需要一系列的
33、对照品来进行比较以获取蛋白纯度是否达标。19参考文献1国家药典委员会，中国药典2010年版三部中国医药科技出版社，2010112肖浩文，朱平，张爱玲，赵季，黄树其，检测聚丙烯酞胺凝胶中蛋白质的3种染色方法比较J生物技术通讯，1999，021391403吴少辉，巫秀美，张成桂，董光平，刘光明，SDS丙烯酞胺凝胶电泳4种染色方法的比较研究J安徽农业科学，2012,105763576457704张瑶，刘芳，张页，一种改良的蛋白质电泳考马斯亮蓝G250染色方法J基础医学与临床，2012，089539555陈琳，张亚东，赵艳华，马平，卜凤荣，三种蛋白染色方法在SDS一聚丙烯酞胺凝胶电泳中的应用J军事医学
34、科学院院刊，2000,042922946蔡晓丹，王理，徐晓利，一种改良的蛋白质双向电泳银染色法J生物化学与生物物理进展，1986，0366687牛敏，陈汉芳，颜英俊，尹一兵，蛋白质凝胶电泳银染色法的改进J江西医学检验，2006，015556548周旋，倪茂巍，陈茂，朱忠欣，丛维涛，凝胶上蛋白质染色方法研究进展J中国医药生物技术，2011，053783819秦慧，刘霆，柳斌，宋鑫，黄欣，杨金亮，赵霞，魏于全，几种双向凝胶电泳蛋白质检测方法的比较J中国实验血液学杂志，2006，0116817210肖浩文，朱平，张爱玲，赵季，黄树其，三种染色方法用于检测聚丙酞胺凝胶中蛋白质的比较J解放军广州医高专学
35、报，1998,0211912111王理开，聂磊，徐晓利，考马斯亮蓝银染法一种更灵敏的凝胶蛋白染色法J生物学杂志，1988，03313312高裕，刘秀梵，张如宽，蛋白质分析中SDSPAGE银染法与考马斯亮蓝染色法敏感性的比较J江苏农学院院报，1955，02307213俞莲君，SDSPAGE的蛋白质染色方法J郑州牧业工程高等专科学校学报，1995，0251525520致谢本论文在艾小康导师的悉心指导下完成的。导师渊博的专业知识、严谨的治学态度，精益求精的工作作风，诲人不倦的高尚师德，严于律己、宽以待人的崇高风范，朴实无法、平易近人的人格魅力对本人影响深远。不仅使本人树立了远大的学习目标、掌握了基本的研究方法，还使本人明白了许多为人处事的道理。本次论文从选题到完成，每一步都是在导师的悉心指导下完成的，倾注了导师大量的心血。在此，谨向导师表示崇高的敬意和衷心的感谢在写论文的过程中，遇到了很多的问题，在老师的耐心指导下，问题都得以解决。在此我要特别感谢艾小康导师以及实验里很多同学的帮助，有了他们的帮助和支持，我的论文才得以顺利完成。在此，我向曾经给予我关心与帮助的老师、同学、朋友，表达我诚挚的谢意致谢人罗艳萍20140526
