1、附件 7 脑膜炎奈瑟菌实验室检测操作规范一、脑膜炎奈瑟菌鉴定程序和标准1、 脑膜炎奈瑟菌细菌鉴定程序脑膜炎奈瑟菌的鉴定通常是通过在 CAP 和 BAP 上生长物通过革兰染色镜检和生化反应检测以确定是否为脑膜炎奈瑟菌，在此基础上再通过脑膜炎奈瑟菌分群诊断血清进行血清分群。BAP,CAP 生长物革兰氏染色为阴性双球菌氧化酶反应阳性，进行生化鉴定 阴性，非脑膜炎奈瑟菌生化鉴定（糖氧化）Glu Mal Lac Suc 阳性，为脑膜炎奈瑟菌进行血清分群阴性，非脑膜炎奈瑟菌A、B、C、H、I、K、L、W135、X、Y、Z、Z(29E)不同血清群图 xx 脑膜炎奈瑟菌鉴定程序2、 脑膜炎奈瑟菌感染确诊实验室
2、检测疑似流脑病例具有以下实验室检测结果之一，即可确诊：1. 培养：自脑脊液或血液标本中分离到脑膜炎奈瑟菌。2. 乳胶凝集检测：采用乳胶凝集检测试剂盒，脑脊液标本乳胶凝集检测结果阳性，目前 Bio-Rad 乳胶凝集检测试剂盒能检测 A 群、B 群、C 群和W135/Y 群脑膜炎奈瑟菌感染。3. PCR 检测：脑脊液标本或血液标本 PCR 扩增特异性脑膜炎奈瑟菌 DNA片段阳性。 通过 ctrA 基因扩增，鉴定脑膜炎奈瑟菌，通过扩增 orf-2、siaD(B)、siaD(C)、siaD(Y) 、siaD（W135）等基因片段鉴别不同的血清群，或通过 Real-time PCR 检测出特异性基因片段
3、阳性。4. 血清 IgG 抗体滴度 4 倍增高：恢复期血清抗体滴度较急性期 4 倍增高。二、脑膜炎奈瑟菌标本接种培养（一）脑脊液标本 1脑脊液标本预处理 脑脊液标本送到实验室后，应立即离心，2000rpm ，20min，用巴斯德吸管吸取上清，进行乳胶凝集实验检测抗原。离心后的沉淀进行剧烈振荡或充分混合。取 1 滴沉淀准备革兰染色，1 滴划线接种原始培养基。（注意:如果获得的脑脊液不足 1mL 则不进行离心，直接用其进行革兰染色和涂板培养）。2. 脑脊液标本初代培养 脑膜炎奈瑟菌的初代接种培养基为巧克力琼脂平板。将离心后的脑脊液标本沉淀滴加至巧克力琼脂平板，取菌环划线接种。置5%的 CO2 孵箱
4、或燃有蜡烛的烛缸中培养。也可将一些沉淀接种备用肉汤培养基（如脑心浸液肉汤培养基），进行孵育培养。如果用 T-I 培养基进行运输，在孵育 24h 后，用无菌的针或注射器转移 100 l T-I 培养基的液体部分到 BAP 及CAP 上，并划线分离。3. 脑脊液标本革兰染色（Hucker 改进方法） 脑脊液标本离心沉淀物革兰染色或采用乳胶凝集方法检测 CSF 中特殊的抗原成分两种检测方法，可作为流感嗜血杆菌、肺炎链球菌和脑膜炎奈瑟菌引起的细菌性脑膜炎的初步诊断。即使标本培养阴性，革兰染色或乳胶凝集检测结果阳性或其中任何一个检测结果阳性即可以作为感染的证据。（1） 脑脊液标本离心，2000rpm，2
5、0min。（2） 酒精清洗并干燥的玻片，滴加 1 滴2 滴沉淀物，允许多滴汇集成一个大滴，不要铺开液体或使用过高浓度的沉淀物。可能的情况下，在生物安全柜中风干玻片。（3） 将玻片三次快速通过火焰以固定涂片，不应该灼干。也可以使用异丙醇（95-100）固定。（4） 草酸铵结晶紫染色玻片，1min。流水冲洗玻片 1min，并去除多余的水分。（5） 革兰氏碘液染色玻片，1min。流水冲洗玻片并干燥。（6） 95%的乙醇脱色（5s-10s 足够）。（7） 番红精复染 20s-30s 或用酚红复染 10s-15s。流水冲洗玻片并拭干玻片。显微镜观察染色的涂片，用亮视野的透镜和油镜。脑膜炎奈瑟菌通常出现在
6、多形核白细胞内或细胞外，革兰阴性、咖啡豆形双球菌。（二）血液标本1. 接种血培养瓶：采取血液标本后直接接种血培养瓶，应在培养前排气，放置在 35，排气通常是在血培养瓶的橡胶部分插入一个塞有棉花的无菌针头来实现。2.传代培养（1）血培养瓶观察 血培养瓶在培养 14h17h 后开始进行观察，以后每天都要进行观察，直至第 7 天。红血球发生任何混浊或溶解都可能是细菌生长的指示，应该立即进行传代培养。脑膜炎奈瑟菌很脆弱，因此不管血培养瓶的表象是否变化，培养 14h17h、48h 和 7 天时都应进行传代。出现浑浊和细菌生长二者并不一定有相关性，不出现浑浊并不意味着细菌一定没有生长。在传代前应搅动瓶子混
7、匀内容物。（2）血培养瓶培养物转种 用乙醇和聚烯吡酮碘拭子消毒血培养瓶橡胶塞表面，用带针头的注射器从血培养瓶中吸取少量（0.5mL）液体，接种于巧克力琼脂平板（CAP）和血琼脂平板(BAP)。当只使用一种琼脂时，应该接种CAP，因为 CAP 含有流感嗜血杆菌生长所必需的因子，而 BAP 是没有的。划线方式接种琼脂平板，在 CO2 空气中培养至 48h。当细菌的生长已经通过血琼脂传代而确定时，则不需要再继续培养血培养瓶。瓶子应该按照生物安全程序处理。（三）、T-I 培养基T-I 培养基接种标本后，培养 24h，用无菌针头或注射器将 100l T-I 培养基液体加至 BAP 和 CAP 上，划线，
8、CO 2 空气中 35培养至 48h。可通过革兰染色检测生长物纯度。如果 BAP 或 CAP 琼脂上没有细菌生长，应分别在第 3天和第 7 天再次进行传代培养。培养后的 T-I 培养瓶应该按照生物安全程序处理。（四） 、脑膜炎奈瑟菌形态学特征BAP 平板上的脑膜炎奈瑟菌新鲜菌落呈现圆形，光滑、湿润、光泽、中央凸起、有完整的边界，一些菌落与周围的菌落接合。培养物灰色，不产生色素，陈旧菌落变成灰色半透明，有时导致底部琼脂变暗。充分分开的菌落可以在18h 生长成直径为 1mm，几天后变为 4mm，有时带波浪形的边界。 三、脑膜炎奈瑟菌生物化学特征和鉴定生长一天的培养物检测结果会好一些。革兰染色检查生
9、长物的纯度是最常进行的检测（脑膜炎奈瑟菌是一种革兰阴性、咖啡豆样的双球菌）。如果有必要，需要进行再次传代培养以保证纯度。取 BAP 培养基上的生长物，进行Kovacs 氧化酶实验，并鉴定血清群。最后，用碳水化合物（糖类）反应确认实验结果。（一） Kovacs 氧化酶实验氧化酶实验测定的是细胞色素氧化酶。含有细胞色素酶 C（呼吸链上的一种成分）的微生物可以将四甲基-p-苯二胺氯化物转变为紫色化合物。1 制备 1的氧化酶试剂为防止储存的粉状氧化酶试剂变质，应将其置于封闭干燥的瓶子中，存放于阴凉处。用蒸馏水制备 10mL 1的四甲基-p- 苯二胺氯化物溶液，分装为1mL 的等份体积，-20冻存。使用
10、时，融化 1 管 1mL 试剂，并在无孔表面（如：Petri 碟、玻璃平皿等）润湿尽可能多的滤纸条。自然风干滤纸条。等滤纸条完全干燥后，将其放入严密封盖的试管或瓶子中，4保存，随用随取。注意：氧化酶试剂只能做体外诊断用。避免沾染皮肤和眼睛。它可引起刺痛。不慎沾染时，立即用大量清水冲洗眼睛或皮肤至少 15min。2.实验操作用铂金接种环、一次性塑料环或木质面签，挑取一部分待测试的菌落，涂抹至制备好的滤纸条上。不要使用镍铬合金环，因为它可能导致假阳性反应。3.实验结果的判读脑膜炎奈瑟菌不太可能出现延迟反应，10 秒钟之内呈紫色为阳性反应。这只是脑膜炎奈瑟菌的辅助识别实验，奈瑟菌属的其它细菌以及其他
11、无关的菌种，也可能会出现阳性反应。（二） 脑膜炎奈瑟菌碳水化合物利用检测（胱氨酸胰酶解酪蛋白琼脂法)碳水化合物利用实验可用来进一步验证脑膜炎奈瑟菌菌株，不同的碳水化合物加到胱氨酸胰酶解酪蛋白琼脂中，终浓度为 1。确定一个菌株是否是脑膜炎奈瑟菌，可使用四种单糖糖管（葡萄糖、麦芽糖、半乳糖和蔗糖），奈瑟氏菌属细菌产酸是通过氧化碳水化合物而不是通过发酵碳水化合物。脑膜炎奈瑟菌能氧化葡萄糖和麦芽糖，不能氧化半乳糖和蔗糖。培养基中含有敏感的酚红指示剂，当有酸存在时（pH6.8）时显示黄色。1.实验操作步骤用接种针头从 BAP 或 CAP 过夜培养物中取少量菌培养物。几次穿刺接种物至培养基上部 10mm。
12、接种不同的待测碳水化合物培养基，要使用单独的针头或灼烧针头。旋紧管子的帽子，放入 35孵箱（不需要 CO2），至少培养72h，如果还是阴性就丢弃。2.实验结果的读取可见浊度加深并且培养基的上部变成黄色说明细菌生长并产酸，可以认为结果阳性。虽然反应有时可以在接种 24h 发生，但是一些反应延迟，培养 72h之前不能轻易认定为阴性结果。3.奈瑟氏菌属和摩拉克氏菌属的一些种碳水化合物的利用见表产酸来源菌种 葡萄糖 麦芽糖 半乳糖 蔗糖脑膜炎奈瑟菌淋球菌干燥奈瑟氏菌乳糖奈瑟氏菌摩拉克氏菌+ + - -+ - - -+ + - + + + - - - -四、脑膜炎奈瑟菌免疫学检测（一）脑膜炎奈瑟菌血清学
13、鉴定1.脑膜炎奈瑟菌血清目前，基于荚膜多糖已确定了 13 个不同的血清群：A、B、 C、H 、I 、K、L、W135、X、Y、Z、Z(29E) ，D 血清群已不再检测。A、B、 C、W135 及 Y 是最常见的引起脑膜炎的血清群。 A 群是导致非洲和亚洲脑膜炎流行的最主要血清群，其次是 C 群，现在已有商业化的分群血清，包括美国 Remal 血清、BD 脑膜炎奈瑟菌诊断血清、法国 Bio-Mureux 诊断血清等。2.血清学鉴定操作（1）用乙醇擦净一块载玻片，用蜡笔或其它记号笔将载玻片分为三个部分，每个部分 10mm4mm。（2）在每个部分的近底部处加 10l 0.5的生理盐水，用无菌接种环、
14、针、无菌涂棒或牙签从巧克力平板或血平板上采取细菌培养物，在生理盐水中，将培养物制成用于测试的略呈乳液状的悬液。注意：出于安全考虑，推荐使用福尔马林灭活的脑膜炎奈瑟菌悬液，而不是活菌的生理盐水悬液。福尔马林是一种致癌物，在储存和使用时须高度小心，操作应在安全柜中进行操作。（3）在每个部分的上部加上所选的血清各 10l 以及 10l 生理盐水或PBS。（4）在亮光下或黑色背景下，将抗血清或生理盐水与各自的培养菌悬液混合，摇动玻片 1min-2min（时间可能会因为血清的制造者不同而有所差异）。3.实验结果的读取（1）凝集应该只与一种血清凝集而与生理盐水不发生凝集。（2）在生理盐水中凝集说明培养菌有
15、自凝性。（3）和几种抗血清凝集而无自凝现象，说明培养菌的粗糙的。（4）和任何一种抗血清或生理盐水都不能发生凝集，说明菌株为不能分群菌株。这样的结果在新鲜分离株中很少发生，但确实会偶尔发生。（二）脑膜炎奈瑟菌乳胶凝集检测1.乳胶凝集试剂现在有几种商品化的试剂盒可用，目前商业化的试剂盒包括 Bio-Rad 公司产品以及 BD 公司产品。当使用这些试剂盒时，应严格遵照制造商的操作说明进行，为了获得最佳的结果，CSF 样本上清应尽快检测；如果不能立即检测，样本在几个 h 内应冷藏在 2-8，或保存在-20，可以冻存更长的时间。试剂应该 2-8保存，在较高的温度时，尤其是在热带地区，试剂会被破坏，即使在试剂盒的有效期内测试结果也可能会导致偏差结果。乳胶悬液试剂不应该冻存。2.乳胶凝集监测操作步骤（1) CSF 上清在沸水浴中加热 5min。（2) 轻摇乳胶悬液直至均匀。（3) 在环形玻片或一次性卡片上，每种乳胶悬液滴加 1 滴。（4) 向每种悬液滴加 30l-50l CSF。（5) 用手摇动 2min-10min，建议在可能的情况下 100rpm 机械摇动。见3.实验结果的读取在亮光下读取，不需要扩大倍数。（1) 阴性反应：悬液仍呈现均质状并出现肉眼可见轻微的牛奶状外观。（2) 阳性反应：2min 内，乳胶颗粒凝集（或可见团块）。注意：逆向免疫电泳可能也可用于 CSF 中直接抗原的检测。
