1、第 2 章DNA重组克隆的单元操作 DNA重组的载体； DNA的体外重组； 重组 DNA分子的转化与扩增； 转化子的筛选与重组子的鉴定； 目的基因的克隆。2.1 用于基因克隆的载体质粒（ plasmid）噬菌体考斯质粒（ cosmid） 与噬菌粒人造染色体载体载体的功能及特征载体的功能及特征1.载体的功能 为外源基因提供进入受体细胞的转移能力 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件2.载体应具备的条件 具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性。 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点。 具有合适的筛选标记。 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。 质粒1.质粒的基
2、本特征质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子。质粒常见于原核细菌和真菌中。绝大多数的质粒是 DNA型的。绝大多数的天然 DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构。质粒 DNA的分子量范围： 1 - 100 kb。质粒的自主复制性： 拷贝数的控制机制 质粒 DNA复制启动控制控制复制引物与模板的结合oriE.coli ColE1 plasmid复制方向rop（ +）RopRNA IIRNA I3553质粒质粒的基本特征质粒的自主复制性： 拷贝数的控制机制 质粒 DNA复制启动控制控制复制起始因子与复制起始位点（ ori） 的结合Pcop cop P/Or
3、ep rep oriCop Rep 可扩增性根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：严紧型复制控制的质粒 1 - 5 拷贝 stringent plasmid松弛型复制控制的质粒 30 - 50 拷贝 Relaxed plasmid 质粒的可转移性革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类： 接合型质粒： 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用）。 非接合型质粒：不能在天然条件下独立地发生接合作用。 质粒的不相容性 任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性。以大肠杆菌的质粒为例：ColE1、 pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容pSC101、 F拥有相似的复制子结构，彼此不相容
