1、藻类叶绿素 a 的测定一、实验名称藻类叶绿素 a 的测定二、实验目的(水)环境化学中叶绿素 a 测定意义在地表水环境的富营养化的研究中，叶绿素 a 是表征浮游植物生物量的最常用的指标之一。同时，叶绿素 a 也是用来衡量水体水质，评价水体富营养化水平的标准之一。三、 实验原理叶绿素介绍叶绿素是植物进行光合作用的主要脂溶性色素，它在光合作用的光吸收中起核心作用。所有光合器官中都含有叶绿素。叶绿素 a 和 b 都溶于乙醇、乙醚、丙酮等，难溶于石油醚，有旋光，主要吸收橙红光和蓝光。因此，这两种光对光合作用最有效。当植物细胞死亡后，叶绿素即游离出来，游离叶绿素不很稳定，光、热、酸、碱、氧、氧化剂等都会使
2、其分解。在酸性条件下，叶绿素中的镁原子很容易被其他酸代替，绿色消失而变黄，叶绿素生成绿褐色的脱镁叶绿素，加热时反应加速。叶绿素的实验室测量方法有分光光度法、荧光法、色谱法，其中以传统的分光光度法应用最为广泛。根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。根据朗伯-比尔定律，某有色溶液的吸光度 A 与其中溶质浓度 C 和液层厚度 L 成正比，即：A =CL式中： 为比例常数。当溶液浓度以百分比浓度为单位，液层厚度为 1cm 时， 为该物质的吸光系数。各有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下
3、的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和，这就是吸光度的加和性。（1）单色法已知叶绿素 a 的 80丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为 663nm，已知在波长663nm 下，叶绿素 a 在该溶液中的比吸收系数分别为 82.04，因此 CA=A663/82，可以计算出叶绿素 a 的含量(mg/L)。（2）三色法已知叶绿素 a、b 的 80丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为 663nm 和 645nm，且两吸收曲线相交于 652nm 处。因此测定提取液在 645nm、663nm、652nm 波长下的吸光值，根据经验公式便可分别
4、计算出叶绿素 a、叶绿素 b 和总叶绿素的含量。已知在波长 663nm 下，叶绿素 a、b 在该溶液中的比吸收系数分别为 82.04 和 9.27，在波长 645nm 下分别为 16.75 和 45.60，可根据加和性原则列出以下关系式： A663=82.04Ca +9.27Cb(1) A645=16.75Ca+45.6Cb(2) 式中 A663、A664 分别为波长 663nm 和 645nm 处测定叶绿素溶液的吸光度值；Ca、Cb分别为叶绿素 a、b 的浓度(g/L)。 解联立方程(1)、(2)可得以下方程： Ca=0.0127A663-0.00269A645(3)Cb=0.0229A64
5、5-0.00468A663(4)如把叶绿素含量单位由 g/L 改为 mg/L，(3)、(4)式则可改写为： Ca(mg/L)=12.7A663-2.69A645(5)Cb(mg/L)=22.9A645-4.68A663(6)叶绿素总量 CT(mg/L)=Ca+Cb=20.2A645+8.02A663(7)叶绿素总量也可根据下式求导 A652=34.5CT由于 652nm 为叶绿素 a 与 b 在红光区吸收光谱曲线的交叉点(等吸收点)，两者有相同的比吸收系数(均为 34.5)，因此也可以在此波长下测定一次吸光度(A652)求出叶绿素总量：CT(g/L)=A652/34.5CT(mg/L)=A65
6、21000/34.5(8)因此，可利用(5)、(6)式可分别计算叶绿素 a 与 b 含量，利用(7)式或(8)式可计算叶绿素总量。从上可见，叶绿素提取后测定又可以分为两种：单色法(663nm)与三色法(645nm、663nm、652nm)。具体使用单色法还是三色法将依据测定对象而定。在标准方法、超声波法、反复冻融法、延时提取法、热丙酮法、丙酮加热法、热乙醇法、混合溶剂法等多种常见浮游植物叶绿素 a 测定方法中，针对实验室培养的微囊藻（ Microcystis aeruginosa）水华样品为研究对象进行的叶绿素 a 含量测定。不管是从叶绿素 a 提取的完全性、测定数据的稳定性、试验操作的简便性
7、考虑等方面来看，包括国家标准方法在内的大多数方法，存在操作耗时长、过程复杂、叶绿素提取不完全的缺点；而以丙酮加热法测量叶绿素 a 的提取效率高、数据稳定性好，操作耗时短、简便，可推荐作为一种常用的浮游植物叶绿素 a 的测量方法，尤其是应急监测或大批量水环境样品测定时更显现优势(表 1)。表 1 不同提取方法实验耗时情况测定方法 标准方法 延时提取法热丙酮法 反复冻融法超声提取法丙酮加热法热乙醇法 混合溶剂法 /(gL-1) 0.974 1.011 1.216 1.435 1.517 1.635 1.026 1.397标准方差 0.149 0.163 0.157 0.064 0.253 0.07
8、2 0.077 0.126变异系数 15.7 16.0 14.7 3.91 16.5 3.26 5.24 9.42实验耗时/h 8-8.5 7-7.5 9-9.5 24 21 1.5-2 8-9 8-9丙酮加热法测定的注意事项：随着水浴加热过程温度的升高，丙酮的萃取能力得到增强，而且提取过程耗时短、操作简单，样品基本没有损失。但在实验过程中，加热的时间与温度控制很重要，且需要采取避光措施。温度过高、有光照条件以及加热时间过长，均可能破坏叶绿素 a 的稳定性。四、材料、仪器设备及试剂 材料：待测浮游藻；本实验采用蓝藻产毒铜绿微囊藻（左）与绿藻蛋白核小球藻（右） 。仪器设备：5mL 或 1mL 移
9、液枪、5mL 或 1mL 枪头、10mL 离心管、离心机、锡箔纸、水浴锅、温度计、10mL 刻度试管、比色皿、分光光度计。试剂：80丙酮。 五、实验步骤实验一、确定藻密度的蓝藻藻液。用移液枪吸取 2mL 蓝藻液置于 10mL 离心管中，于 12000rpm离心 5min，用移液枪吸去上清液。藻饼于 2mL 80%丙酮中重悬浮，后用锡箔纸完全包裹10mL 离心管，并置于光线较暗处 55C 水浴放置 30min，后于 12000rpm 离心 5min，吸出上清液转移至 10mL 刻度试管中，并用 80%丙酮定容于 5mL，测定 663nm 处的光吸收值，测定结果按照 CA=OD663/82，计算出
10、叶绿素的含量(mg/L)。实验二、确定藻密度的绿藻藻液。用移液枪吸取 2mL 绿藻液置于 10mL 离心管中，于 12000rpm离心 5min，用移液枪吸去上清液。藻饼于 2mL 80%丙酮中重悬浮，后用锡箔纸完全包裹10mL 离心管，并置于光线较暗处 55C 水浴放置 60min，后于 12000rpm 离心 5min，吸出上清液转移至 10mL 刻度试管中，并用 80%丙酮定容于 5mL，测定 663nm 处的光吸收值，测定结果按照 CA=A663/82，计算出叶绿素 a 的含量(mg/L)。用移液枪吸取 2mL 绿藻液置于 10mL 离心管中，于 12000rpm 离心 5min，用移
11、液枪吸去上清液。藻饼于 2mL 80%丙酮中重悬浮，后用锡箔纸完全包裹 10mL 离心管，并置于光线较暗处 55C 水浴放置 30min，后于 12000rpm 离心 5min，吸出上清液转移至 10mL 刻度试管中，并用 80%丙酮定容于 5mL，测定 663nm、645nm、652nm 处的光吸收值，测定结果按照三色法公式，可计算出叶绿素 a、叶绿素 b 与总叶绿素的含量(mg/L)。根据下式，计算出原藻液中各叶绿素的含量(mg/L)： CmgLLhl/(/)提 取 液 总 量 ()（ )=初 始 体 积根据下式，计算出不同藻液中单个细胞各叶绿素的含量(g/个细胞)： ()-1ghlg/(
12、/)提 取 液 总 量（ 细 胞 )藻 细 胞 总 数 个六、实验数据处理在不同波长下分别测蓝藻和绿藻的吸光度，数据记录如下表：663nm 645nm 652nm蓝藻 0.772 绿藻 0.052 0.029 0.039对蓝藻的叶绿素计算用公式 CA=OD663/82，计算结果见下表 45.6对绿藻的叶绿素 a、叶绿素 b 与总叶绿素分别用公式：Ca(mg/L)=12.7A663-2.69A645Cb(mg/L)=22.9A645-4.68A663CT(mg/L)=A6521000/34.5计算结果如下表：叶绿素 a（mg/L） 叶绿素 b（mg/L） 总叶绿素（mg/L）蓝藻 0.0094
13、0.0094绿藻（三色法） 0.5824 0.4207 1.0031绿藻（单色法） 0.6341 0.6360 1.2701 根据下式，计算出原蓝藻和绿藻溶液中各叶绿素的含量(mg/L)： CmgLLhl/(/)提 取 液 总 量 ()（ )=初 始 体 积结果见下表：叶绿素 a（mg/L） 叶绿素 b（mg/L） 总叶绿素（mg/L）蓝藻 0.0235 0.0235绿藻 1.4560 1.0518 2.5078 根据下式，计算出蓝藻和绿藻中单个细胞各叶绿素的含量(g/个细胞)： ()-1CmgLLhlg/(/)提 取 液 总 量（ 细 胞 )=藻 细 胞 总 数 个蓝藻藻液密度为 3.3x1
14、07 个/mL，即每毫升蓝藻藻液中含有 3.3x107 个蓝藻细胞。绿藻藻液密度为 8.4x107 个/mL，即每毫升绿藻藻液中含有 8.4x107 个绿藻细胞。结果见下表：叶绿素 a（g/细胞） 叶绿素 b（g/细胞） 总叶绿素（g/细胞）蓝藻 7.1x10-13 7.1x10-13绿藻 1.735x10-11 1.252x10-11 2.987x10-11七、 结果与讨论（1）请说明蓝藻只采用单色法测定叶绿素的原因。单色分光光度法测定叶绿素含量时，要测定 665 和 750nm 处的吸光度。蓝藻只含有叶绿素 a，不含有叶绿素 b，所以只采用单色法测定叶绿素。（2）请比较绿藻单色法与三色法测
15、定结果的差异，并说明理由。从单色法与三色法的测定结果比较得出，一般单色法测定的Chl-a的数值要高于三色法。因为，单色法计算所得的叶绿素a的含量是在663nm处所有吸光的叶绿素含量，不仅仅包括叶绿素a，还有部分叶绿素b，而三色法计算所得的叶绿素a减去了在663nm处吸光的叶绿素b的含量，计算所得的是纯叶绿素a的含量，所以单色法的测定结果要高于三色法的测定结果。（3）试分析叶绿素含量单位 mg/L 与 g/个细胞的意义，与可能适用的情况。叶绿素含量以 mg/L 为单位时表示的是每升藻液中叶绿素的含量，而以 g/个细胞为单位时表示的是藻液每个细胞内含有的叶绿素的含量，后者体现了藻密度对叶绿素含量的影响。当需要表示藻类叶绿素的总体含量时用 mg/L 为单位，要表示藻类单个细胞中叶绿素含量高低时用 g/个细胞。
