1、1血凝抑制（HI）试验简介（以禽流感病毒为例）一、原理流感病毒颗粒表面的血凝素（HA）蛋白，具有识别并吸附于红细胞表面受体的结构，HA 试验由此得名。HA 蛋白的抗体与受体的特异性结合能够干扰 HA蛋白与红细胞受体的结合从而出现抑制现象。二、应用该试验是目前 WHO 进行全球流感监测所普遍采用的试验方法。可用于流感病毒分离株 HA 亚型的鉴定，也可用来检测禽血清中是否有与抗原亚型一致的感染或免疫抗体。三、缺点只有当抗原和抗体 HA 亚型相一致时才能出现 HI 现象，各亚型间无明显交叉反应；除鸡血清以外，用鸡红细胞检测哺乳动物和水禽的血清时需要除去存在于血清中的非特异凝集素；需要在每次试验时进行
2、抗原标准化；需要正确判读的技能。四、试验步骤1 阿氏（Alsevers）液配制称量葡萄糖 2.05g、柠檬酸钠 0.8g、柠檬酸 0.055g、氯化钠 0.42g，加蒸馏水至 100mL，散热溶解后调 pH 值至26.1，69kPa 15min 高压灭菌，4保存备用。 （3.8%枸橼酸钠（3.8g 枸橼酸钠，100ml 超纯水） ，101 kPa,20min 高压灭菌，4保存备用,保存期 1 个月） 。2 10%和 1%鸡红细胞液的制备2.1 采血 用注射器吸取阿氏液约 1mL（3.8%枸橼酸钠） ，取至少2 只 SPF 鸡（如果没有 SPF 鸡，可用常规试验证明体内无禽流感和新城疫抗体的鸡）
3、 ，采血约 24mL，与阿氏液混合（3.8%枸橼酸钠） ，放入装 10mL 阿氏液（生理盐水）的离心管中混匀。2.2 洗涤鸡红细胞 将离心管中的血液经 15001800 r/min 离心 8 分钟，弃上清液，沉淀物加入阿氏液（生理盐水） ，轻轻混合，再经 15001800 r/min 离心 8 分钟，用吸管移去上清液及沉淀红细胞上层的白细胞薄膜，再重复 2 次以上过程后，加入阿氏液 20 mL（生理盐水） ，轻轻混合成红细胞悬液，4保存备用，不超过 5 天。2.3 10%鸡红细胞悬液 取阿氏液保存不超过 5 天的红细胞，在锥形刻度离心管中离心 15001800 r/min 8 分钟，弃去上清液
4、，准确观察刻度离心管中红细胞体积(mL)，加入 9 倍体积(mL)的生理盐水，用吸管反复吹吸使生理盐水与红细胞混合均匀。3（此步可省略，直接配制 1%红细胞）2.4 1%鸡红细胞液 取混合均匀的 10%鸡红细胞悬液 1 mL，加入 9 mL 生理盐水，混合均匀即可。 （根据检测血清的数量，估算一下需要的 1%鸡红细胞量，可按 0.3ml/每份血清）3 抗原血凝效价测定（HA 试验，微量法）3.1 在微量反应板的 1 孔12 孔均加入 25l PBS（生理盐水） ，换滴头。3.2 吸取 25l 抗原加入第 l 孔，混匀。3.3 从第 1 孔吸取 25l，病毒液加入第 2 孔，混匀后吸取 25l
5、加入第 3 孔，如此进行倍比稀释至第 11 孔，从第 11 孔吸取 25l 弃之，换滴头。3.4 每孔再加入 25l PBS（生理盐水） 。3.5 每孔均加入 25l 体积分数为 1%鸡红细胞悬液（将鸡红细胞悬液充分摇匀后加入） 。3.6 振荡混匀，在室温（2025）下静置 40min 后观察结果（如果环境温度太高，可置 4环境下反应 1 小时） 。对照孔红细胞将呈明显的钮扣状沉到孔底。3.7 结果判定 将板倾斜，观察血凝板，判读结果（见下表） 。4表 1：血凝试验结果判读标准类别 孔 底 所 见 结果12345红细胞全部凝集，均匀铺于孔底，即 100%红细胞凝集红细胞凝集基本同上，但孔底有大
6、圈红细胞于孔底形成中等大的圈，四周有小凝块红细胞于孔底形成小圆点，四周有少许凝集块红细胞于孔底呈小圆点，边缘光滑整齐，即红细胞完全不凝集+-能使红细胞完全凝集（100%凝集，+）的抗原最高稀释度为该抗原的血凝效价，此效价为 1 个血凝单位（HAU） 。注意对照孔应呈现完全不凝集（-） ，否则此次检验无效。4 血凝抑制（HI）试验（微量法）4.1 根据 3 的试验结果配制 4HAU 的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除以 4即为含 4HAU 的抗原的稀释倍数。例如，如果血凝的终点滴度为 1:256，则 4HAU 抗原的稀释倍数应是 1:64（256 除以4） 。4.2
7、 在微量反应板的 1 孔11 孔加入 25l PBS（生理盐水） ，第 12 孔加入 50l PBS（生理盐水） 。4.3 吸取 25l 血清加入第 1 孔内，充分混匀后吸 25l于第 2 孔，依次倍比稀释至第 10 孔，从第 10 孔吸取 25l弃去。4.4 1 孔11 孔均加入含 4HAU 抗原 25l，室温（约20）静置至少 30min。54.5 每孔加入 25l 1%的鸡红细胞悬液混匀，轻轻混匀，静置约 40min（室温约 20，若环境温度太高可置 4条件下进行） ，对照红细胞将呈现钮扣状沉于孔底。4.6 结果判定试验成立的条件：只有阴性对照孔血清滴度不大于21og2，阳性对照孔血清误
8、差不超过 1 个滴度，试验结果才有效。以完全抑制 4HAU 抗原的血清最高稀释倍数作为 HI 滴度。HI 价小于或等于 31og2 判定 HI 试验阴性；HI 价大于或等于 41og2 为阳性。五、HI 试验注意事项1、合理选择抗原和对照阳性血清。针对 Re-4 和 Re-5株疫苗免疫采用相应抗原和对照阳性血清。同一亚型的禽流感病毒制成的抗原，如果毒株来源不同，则可能会存在抗原性差异，从而使检测同一血清的结果有差别。一般来讲，疫苗种毒株如果与抗原所用毒株相同时，则所测得的 HI 效价较高。2、合理使用和保存抗原。反应试剂要按规定保存和使用，冻干的试剂应按照说明中规定的体积重新溶解并保存。要避免
9、杂菌污染，因为污染所造成的非流感起源的凝集素也可与所有抗血清发生非特异反应。为避免反复冻融和细6菌污染，可以无菌操作将试剂分装成小包装。3、反应温度不能太高。若在 37 （如温箱）下进行，会影响检测结果。4、掌握好孵育时间。本操作中 HA 和 HI 试验中加入红细胞后的作用时间均为 40 分钟，主要是参照 OIE 标准，在一些病毒株中可见红细胞从病毒中解脱，如果有这种情况的发生，要提前判定(约 2530 分钟)或 4下孵育。一般来讲，主要看红细胞对照孔，对照完全沉淀时要迅速判读。5、标准抗原稀释液浓度必须为 4 个 HA 单位，必须每天制备并在试验前滴定。抗原标定方法血凝板 1 2 3 41、
10、稀释液（l） 25 25 25 252、4 单位抗原 253、从第 2 孔开始倍比稀释到第 4 孔，最后一孔弃去说明 1：稀释度 1:2 1:4 1:8 1：16说明 2：抗原滴度 2 倍 1 倍 0.5 倍 0.25 倍4、1%红细胞（l） 25 25 25 25微量振荡器混匀，室温放置 40min,观察76、红细胞悬液要始终符合标准，使用时应随时振荡。7、反应体系为 75l。8、每次试验时均应设 2 个阳性血清对照、1 个阴性对照。阳性对照孔血清误差不超过 1 个滴度，试验结果才有效。阳性血清的标定：具体操作可在购进一批标准阳性血清以后，取几瓶血清，溶解到一起，分成小包装，-70(无条件者
11、可用-20)保存备用，每次用时取一小管。标定时取冻存血清 1 支，由几个操作人或分几次(红细胞等最好是分别配制)测定阳性血清效价，取平均值作为最终的标准阳性血清效价。大量检测时不需每板均做阳性对照，一般可在试验前、中、后分别设阳性对照。9、注意非特异性凝集素的消除。禽类血清中，尤其是水禽血清，往往含有非特异性血凝抑制因子，在做禽流感血凝抑制试验时会出现 2-3 孔有凝集现象。因此，在利用血凝抑制试验进行血清抗体测定之前，有必要对血清中非特异性因子进行排除。可采用被调查的同种家禽的红细胞。也可采取 56 水浴 30min，加入等体积的 1%鸡红细胞，混匀，室温静置 30min,1500-1800
12、rpm,离心 5-10min,取上8清检测，结果判定时增加一个滴度。10、容易出现的错误。在进行试验操作时很容易出现错误，所以进行实验时一定要严格操作，每次测定应有严格的温度范围和作用时间，出现错误时要认真查找原因，以免类似错误再次出现。以下是容易出现的错误： （1）对照孔凝集 盐类凝集：所谓盐类凝集即稀释液中氯化钠达至一定高浓度时，即使没有血清抗体也能发生凝集反应。 当生理盐水被细菌污染时也可出现对照孔凝集。 血清变质或受细菌污染。 （2）全部凝集 当红细胞受细菌污染或保存时间过长可出现此现象。 抗原滴加时出现失误，工作抗原效价过高。 生理盐水受细菌污染或其它因素。 （3） 红细胞全部下滑 当配制抗原时，配制工作抗原效价过低，不足以凝集鸡红细胞。 加样时所有孔全部加成生理盐水亦出现全部下滑现象。 （4）温度对实验结果也有影响，一般要求在室温下进行实验，当实验温度低于 4时红细胞有时会发生自9凝现象。 （5）抗原与抗体作用时间过长或过短对结果影响较大：过短出现凝集不完全；过长出现洗脱现象。
