1、在中脑导水管周围灰质的催产素通过影响内源性阿片肽参与大鼠痛觉调制杨俊 梁金英 李鹏 潘艳娟 邱培勇 张静 郝方 张大新a 新乡医学院药学院，河南新乡 453003中国b Kamp医学研究所，湖南长沙 410008中国c江苏苏北人民医院，扬州大学，扬州，江苏 225001，中国文章历史2011年 2月 5日收到2011年 4月 15日修订2011年 4月 15日被接受2011年 4月 23日在网上能利用关键词催产素脑啡肽内啡肽强啡肽中脑导水管周围灰质疼痛调节摘要中脑导水管周围灰质在内源性阿片疼痛调制中起着非常重要的作用，肽包括亮氨酸脑啡肽（L - EK），甲硫氨酸脑啡肽（M-Ek），-内啡肽（-
2、内啡肽）和强啡肽 A1-13.我们以前的研究表明，在中脑导水管周围灰质注射催产素能增加疼痛阈值，催产素受体的抗体能降低疼痛阈值，其中催产素的镇痛作用能够被催产素受体的抗体对中脑导水管周围灰质的管理所逆转。该实验的目的是为了调查在疼痛过程中在老鼠中脑导水管周围灰质中的催产素的作用。结果表明催产素，亮氨酸脑啡肽，甲硫氨酸脑啡肽，内啡肽而不是强啡肽 A1-13的浓度在中脑导水管周围灰质的液体灌注中增加了在疼痛刺激之后。亮氨酸脑啡肽，甲硫氨酸脑啡肽，-内啡肽，而不是强啡肽 A1-13的浓度在中脑导水管周围灰质的液体灌注中降低了在催产素受体的抗体作用下。催产素诱导的增加的疼痛阈值被纳洛酮降低了，一种阿片
3、受体的拮抗剂.亮氨酸脑啡肽，甲硫氨酸脑啡肽，内啡肽而不是强啡肽 A1-13的在浓度在中脑导水管周围灰质的液体灌注中增加了在外源性的催产素的作用下。结果表明在中脑导水管周围灰质的催产素在疼痛调节中的能够影响亮氨酸脑啡肽，甲硫氨酸脑啡肽，内啡肽而不影响强啡肽 A1-13。中脑导水管周围灰质的催产素在疼痛的调节中通过影响亮氨酸脑啡肽，甲硫氨酸脑啡肽，内啡肽而不是强啡肽 A1-13。介绍中脑导水管周围灰质是位于在中脑被盖下的中脑水管周围的灰质，它在降低疼痛的调节中起着作用，脊髓丘脑束的上行疼痛纤维束也通过向中脑导水管周围灰质发送信息，这和内源性阿片系统有关，在调节疼痛的过程中是一个非常重要的神经结构。
4、催产素，一种肽后激素，主要在下丘脑的室上核和室旁核合成和分泌。这种激素，联合一种载体蛋白(neurophysin)，沿着 被运输到神经垂体，为了下一次释放储存的地方。催产素显著的功能包括分娩中的子宫收缩，在哺乳过程中的泌乳反射，心血管调节，性活动，学习和记忆。最近，它被证明与疼痛调节有关。脑室注射的催产素能增加疼痛阈值，而抗催产素的管理能降低疼痛阈值。疼痛的刺激改变了大脑中核团催产素浓度的变化，比如说下丘脑视交叉上核，下丘脑腹内侧核，丘脑网状核，蓝斑核，中缝核和尾状核。我们以前的研究证明疼痛刺激降低了催产素在中脑导水管周围灰质组织的密度。针灸不仅诱导阵痛，而且影响了催产素在中脑导水管周围灰质的
5、浓度。我们未发表的材料已经证明在中脑导水管周围灰质注射 10 ng OXT/1l ACSF能增加疼痛阈值从5.00.4mA to 9.81.3mA每10分钟一次(P )。7.10.9mA每30分钟(P )，3.90.5mAat 每分钟20 (P )。在中脑导水管周围k灰质注射0.5ug的催产素受体的抗体或1ugACSF能降低疼痛阈值从5.20.5mA to 4.30.3mA 在10 分钟(P 0.05)，4.70.5mA 在 20 分钟，但是单独在给动物一分钟的疼痛刺激可增加催产素在中脑导水管周围灰质的浓度到189.322.1%在 10分钟 (P 0.001),86.517.5%在 20分钟(
6、P 0.01)和35.714.6%在30, but in灰质注射ACSF不能改变疼痛阈值。给动物1分钟疼痛刺激增加了催产素在中脑导水管周围灰质的密度单独给动物1分钟的疼痛刺激能增加催产素在中脑导水管周围灰质的浓度到189.322.1%在10分钟(P 0.001),86.517.5%在20分钟(P 0.01)和35.714.6%在30分钟, 但是在控制组的中脑导水管周围灰质的液体灌注中的催产素的浓度没有改变。中脑导水管周围灰质的催产素参与了镇痛过程。催产素在结构，合成，来源和分布上和精氨酸加压素非常相似。在中脑导水管周围灰质注射微量的精氨酸加压素能增加疼痛阈值，精氨酸加压素受体的抗体能降低疼痛阈
7、值。精氨酸加压素在中脑导水管周围灰质的镇痛作用是通过内源性阿片肽起作用的。组织学研究在中脑导水管周围灰质已经发现了许多催产素纤维和催产素受体。一些实验已经报告u和k阿片受体抗体可以阻止催产素在中脑导水管周围灰质的镇痛作用。然而和疼痛过程有关的催产素是否影响中脑导水管周围灰质的内源性阿片肽仍然是不明确的。目前的研究试图调查催产素在中脑导水管周围灰质的内源性阿片肽包括亮氨酸脑啡肽（L - EK），甲硫氨酸脑啡肽（M-Ek），-内啡肽（-内啡肽）和强啡肽A1-13.的作用，为了理解催产素在疼痛调节过程中的机制。2材料和方法2.1动物成年雄性SD大鼠，重180-220g,，从扬州大学，扬州，江苏，中国
8、，动物中心获得，它们被安置在有水和食物，并且温度，湿度已经控制好和12小时的白天和黑夜循环的房间里。所有的程序被扬州大学动物保护委员会批准，所有的程序被实施通过国际协会关于疼痛研究的指南2.2材料 催产素, desGly-NH2, d(CH2)5d-Tyr2, Thr-sup-4OVT(OXT受体的特异性拮抗剂），L-Ek, M-Ek,_-Ep and DynA113从 Peninsula Lab, San Carlos, CA,USA.获得。Iodine125从Amersham Pharmacia, Buckinghamshire, UK获得。其他的化学物品从Sigma Co., St. L
9、ouis, MO, USA.购买。兔抗鼠催产素L-Ek, M-Ek, -Ep or DynA113 血清由中国，上海，第二军医学院神经生物学系制作，抗-OXT, L-Ek, M-Ek, -Ep or DynA113血清的特异性和肽本身超过了99.9%，和其他相似的肽的特异性少于0.1%.该抗血清的稀释倍数为1:100,0001:20,000。2.3外科手术在Pellegrino L.J. rat brain atlas的参考下，我们植入了0.5毫米直径的不锈钢套管，在立体定位仪下（江湾集成电路 上海 中国）用无巴比妥钠微量注射或灌注在右侧的中脑导水管周围灰质。导管插管被用丙烯酸固定在颅骨上。所
10、有的操作都在无菌条件下进行的，所有的老鼠在手术后至少有14天的恢复时间。2.4 感受伤害性的实验所有的动物在小笼子里（直径为30厘米，25厘米高度） ，自由活动的情况下进行了测试从8AM10AM，以钾离子透入法诱导疼痛刺激，渗透着钾离子的小湿棉被固定在尾巴上的皮肤上。棉花暴露与直流电中，阳极引导钾离子渗透到尾端的皮肤中。如果电流足够强，渗透的钾离子导致动物感觉疼痛的刺激。电流的强度，在瞬间的反应呗记录为疼痛阈值，被(WQ-9E 疼痛阈值测量仪测量 上海 中国)。这种连续不断地刺激持续10分钟，当老鼠表现出对刺激的反应时立刻终止疼痛刺激。2.5疼痛刺激所有的老鼠在小笼里（直径为30厘米，25厘米
11、高度） ，自由活动的情况下进行了测试从8AM10AM，疼痛刺激作为以上的伤害性实验。疼痛阈值测量的正极产生的直流电通过钾离子的渗透对尾端的皮肤产生了锐痛。强度被固定在疼痛阈值的1.21.4倍，时间在1分钟以上。2.6中脑导水管周围灰质推拉式的灌注一根直径0.3毫米的不锈钢针被直接植入到中脑导水管周围灰质得导管套管中，顶端多出1毫米，为了推动人工脑脊液（ACSF, 包括 0.1MNaCl,1.0mMKH2PO4, 4.0mMKCl, 2.0mMMgSO4, 2.0mMCaCl2, 2.1mMNaHCO3, and 8.0mM glucose)到中脑导水管周围灰质，通过导管套管把ACSF推出去，在
12、向无意识大鼠的中脑导水管周围灰质中推人时，进入的ACFS被加热到37度，提取液在0度下每10分钟收集一次。样品为了被检测在80度下储存。催产素和催产素受体的抗体在中脑导水管周围灰质的用法，包括了催产素和催产素受体抗体在1毫升ACSF中的不同剂量，ACFS在交叉反应中被纯化用一种和液体灌注的方式一样，在中脑导水管周围灰质的推拉式灌注中被推入到中脑导水管周围灰质20分钟以上。事实上，该灌注方式和方法并没有改变，除了两个开着的交叉反应的并联管，其中在1毫升灌注液中有100ng的谷氨酸钠。2.7中脑导水管周围灰质的显微镜下注射实验的当天，用0.3毫米的不锈钢针插入到导管套管中为了中脑导水管周围灰质的显
13、微镜下注射。带有催产素和催产素受体抗体的1ul的ACFS被轻轻的注入到了中脑导水管周围灰质，历时在10分钟以上。2.8放射免疫分析催产素，氨酸脑啡肽（L - EK），甲硫氨酸脑啡肽（M-Ek），-内啡肽（-内啡肽）和强啡肽A1-13.的浓度被专有的抗血清检测，肽被用chloramines-T方法和125Iodine做标记，碘化肽被灵敏度为1.0 pg/tube的Sephadex G-50纯化。本批内各自的变异系数小于3.6%,组间变异小于6.7%。29组织学的检验在高剂量的戊巴比妥钠(80 mg/kg,腹腔注射)下，老鼠死亡以后。我们向中脑导水管周围灰质注入黑色染料观察中脑导水管周围灰质的推拉
14、式和显微镜下注射的组织学定位。如果这个定位不准确，数据将会从分析中排除。2.10数据分析尽管涉及到大鼠脑的图集，大鼠个体差异诱导的微小差别是不能避免的，这导致在同一个组的每只大鼠中脑导水管周围灰质的液体灌注的基础肽的含量是有差距的。如果用绝对值的话，大多组的老鼠能够满足统计学的意义。在中脑导水管周围与它的真正的值相比，每个值应该是0在处理之前。计算公式如下：变化值（）=（现值处理前值处理前值）100所有的值表示为均数均数的标准误和进行了群体之间的方差分析和卡方检验。P0.05被认为有统计学意义。3结论31中脑导水管周围灰质的液体灌注的催产素，亮氨酸脑啡肽（L - EK），甲硫氨酸脑啡肽（M-E
15、k），-内啡肽（-内啡肽）和强啡肽A1-13.的浓度在受到疼痛刺激后增加了。催产素亮氨酸脑啡肽（L - EK），甲硫氨酸脑啡肽（M-Ek），-内啡肽（-内啡肽）和强啡肽A1-13，在中脑导水管周围灰质中.各自的基础浓度是5.21.7 pg/ml, 13.32.2 pg/ml, 14.52.4 pg/ml, 15.62.7 pg/ml and 8.91.7 pg/ml，疼痛刺激不仅增加了催产素的浓度，而且增加了亮氨酸脑啡肽（L - EK），甲硫氨酸脑啡肽（M-Ek），-内啡肽（-内啡肽）的浓度而不是强啡肽A1-13的浓度增加在中脑导水管周围灰质液体灌注中。给老鼠1分钟疼痛刺激，催产素的浓度在中脑
16、导水管周围灰质液体灌注中增加到了198.735.5% 在10分钟(P 0.001) 和108.724.8%在 20分钟 (P 0.01)。亮氨酸脑啡肽的浓度增加到178.532.3% 在 10 分钟(P 0.001) and 97.823.6% 在 20 分钟 (P 0.01)，甲硫氨酸脑啡肽的浓度增加到188.637.4% 在10分钟(P 0.001) 和101.226.6% 在20分钟 (P 0.001)。内啡肽的浓度增加到234.542.7% 在10 分钟(P 0.001) 和 117.527.8% 在20 分钟 (P 0.001)。但是疼痛刺激并不影响强啡肽A1-13在中脑导水管周围灰
17、质液体灌注的浓度。3.2在中脑导水管周围灰质液体灌注的亮氨酸脑啡肽，甲硫氨酸脑啡肽，内啡肽的浓度降低由于催产素受体抗体的作用。向中脑导水管周围灰质注射了1ug催产素受体拮抗剂(desGly-NH2 d(CH2)5d-Tyr2, Thr-sup-4OVT)以后，亮氨酸脑啡肽的浓度降低到64.511.8% 在 10分钟(P 0.001), 57.69.7% 在 20 分钟 (P 0.001) and 43.27.3% 30分钟 (P 0.01).在向中脑导水管周围灰质注射了0.5ug催产素受体拮抗剂后，亮氨酸脑啡肽的浓度降低到40.38.4%在10分钟(P 0.001), 32.16.7%在20分
18、钟(P 0.01) and 20.94.7%在 30分钟 (P 0.05).但是亮氨酸脑啡肽的浓度在控制组中并没有改变。向中脑导水管周围灰质注射了1ug催产素受体拮抗剂，甲硫氨酸脑啡肽的浓度降低到70.113.4% 在 10分钟 (P 0.001), 60.812.5% 在20 分钟 (P 0.001) 和39.47.8% 在 30分钟 (P 0.01). 在向中脑导水管周围灰质注射了0.5ug催产素受体拮抗剂后，甲硫氨酸脑啡肽的浓度降低到38.16.2% 在10 分钟 (P 0.001) 和34.57.9% a在20 分钟(P 0.01). 但是甲硫氨酸脑啡肽的浓度在控制组中并没有改变。向中
19、脑导水管周围灰质注射了1ug催产素受体拮抗剂，内啡肽的浓度降低到53.28.3% 在10 分钟 (P 0.001), 49.76.4% 在20 分钟(P 0.001) 和26.75.1% 在 30分钟 (P 0.001).。在向中脑导水管周围灰质注射了0.5ug催产素受体拮抗剂后，内啡肽的浓度降低28.95.5% at 10分钟 (P 0.001) 和26.54.9% 在20分钟(P 0.01). 但是内啡肽的浓度在控制组中并没有改变。向中脑导水管周围灰质注射了0.5ug或1ug催产素受体拮抗剂后，并不影响强啡肽A1-13的浓度。3.3由催产素引起的疼痛阈值的增加被纳洛酮减弱，一种阿片受体拮抗剂。在显微镜下向中脑导水管周围灰质注射10ug的催产素，能增加疼痛阈值从5.00.3mA 到7.80.7mA 在10 分钟(P 0.001), 6.30.6mA 在20 分钟 (P 0.01) 和5.60.5mA a在30 分钟。5ng纳洛酮的用法，一种阿片受体的拮抗剂，降低了疼痛阈值从
