1、质粒 DNA 电泳的三条带2008-11-11 16:38质粒是细胞内的一种环状的小分子 DNA，是进行 DNA 重组的常用载体。作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外，质粒 DNA 上携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。在 DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。从宿主细胞中提取质粒 DNA，是 DNA 重组技术中最基础的实验技能。分离质粒DNA 有三个步骤：1、培养细菌使质粒扩增2、收集和裂解细菌3、分离和纯化质粒 DNA碱裂解法是较常用的提取的方法。其优点是得率高，适合于大多数的和菌株，所得产物经纯化后可满足多
2、数的 DNA 重组操作。此法采取酸碱度高达Ph12.6 的碱溶液使 DNA 发生变性。由于质粒和主染色体的拓扑结构不同，变性时前者虽然两条链分离，但仍然缠绕在一起不分开；而后者完全变性分，甚至出现断裂。因此，当加入中和液时，溶液 Ph 值恢复较低的近中性水平，此时， 质粒的两条小分子单链可迅速复性，恢复双链结构，但是主染色体 DNA 则无法复性。在离心时，大部分主染色体与细胞碎片，杂质等缠绕一起被沉淀，而可溶性的质粒 DNA 留在上清夜中。在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能使质粒 DNA链发生断裂。所以，多数 质粒粗提取物中含有三种构型的质粒：共价闭合环状 DNA（ccc
3、DNA）： 质粒的两条链没有断裂；超螺旋开环 DNA（ocDNA）： 质粒的一条链断裂；松弛的环状分子线形 DNA（lDNA）： 质粒的两条链均断裂；线性分子质粒 DNA 的分子构型 质粒 DNA 琼脂塘凝胶电泳模式图(a)松弛线性的 DNA；(b)松弛开环的 OC 构型；(c)超螺旋的 SC 构型由于琼脂糖中加有嵌入型染料溴化乙锭，因此，在紫外线照射下 DNA 电泳带成橘黄色。(a)道中的 SC DNA 走在最前沿，OC DNA则位于凝胶的最后边；(b)道中的 L DNA 是经核酸内切限制酶切割质粒之后产生的，它在凝胶中的位置介于 OC DNA 和 SC DNA 之间三、材料、试剂及器具1、
4、材料E.coliDH 5（pUC 19 vector）2、试剂1)LB 培养基2)TE 缓冲液3)裂解液：溶液、溶液、溶液4)酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）5)无水乙醇6)70%乙醇7)氨苄青霉素 50mg/mL器具离心机、离心管、吸嘴四、操作步骤以 1%比例把 E.coliDH5(含 PUC18)接种于含氨苄青霉素（Amp）100g/ml)的LB 培养基中 37振摇过夜（12-18h）取 1.5ml 培养物置离心管中10000rpm,离心 1min，或 4000rpm，离心 5-10min去上清，倒扣干净吸收纸上吸干沉淀+100L 溶液加或不加入少量溶菌酶粉末；混匀，室温放置 10min
5、+加 200L 溶液（新鲜配置）温和颠倒数次，混匀，冰上放置 5min+150l 溶液颠倒混匀，冰上放置 15min离心 12000rpm,15min上清液+等体积酚：氯仿：异戊醇振匀，12000rpm,离心 5min小心转移上层至一新的离心管弃下层有机相和中层蛋白质上清液+2 倍体积无水乙醇混匀，室温 5min-10min12000rpm,5min-15min弃上清沉淀+1mL70%乙醇12000rpm 离心 5min-15min弃上清；并倒扣离心管使液体流干+自然干燥或真空抽干（看不到液滴为宜）加 50lTE 缓冲液（20g/mlRNaseA）溶解质粒粗取物-20保存六、实验报告检查、保存提取的质粒，要求记录实验现象并说明原因。七、思考题分析以下试剂的作用原理：溶液：50mmol/L 葡萄糖5mmol/Ltris HCL (Ph 8.0)10mmol/L EDTA(PH8.0)溶液:0.4mol/L NaOH2% SDS使用前新鲜配制溶液：5mol/L Kac 60 mL冰醋酸 11.5 mL水 28.5 mLRNase A 酶：将粉末溶于 10mmol/L tris HCL (Ph7.5)、15mmol/L NACL 中，配成 10 mg/mL浓度的酶液，于 100水浴加热 15 min，缓慢冷却至室温，-20保存氯仿无水乙醇
