1、实验一油镜的使用和细菌的简单染色一、目的要求1.学习并掌握使用油镜的原理和方法。2.通过简单染色，初步认识细菌的形态特征。3.掌握染色的基本技术和无菌操作技术。二、实验原理1、油镜的使用原理普通显微镜通常配置几种物镜，其中油镜的放大倍数最大，对微生物学研究最为重要。与其他物镜相比，油镜的使用比较特殊，需在载玻片与镜头之间滴加镜油，这主要有两方面的原因：（1）增加照明亮度：油镜的放大倍数为100，其焦距很短，但所需要的光照强度却最大，从玻片透过来的光线，有些会因折射和反射不能进入镜头，致使物象不清。为了不使光线有所损失，在使用油镜时，需在镜头与玻片之间加入与玻璃折射率相仿的镜油（香柏油） 。（2
2、）增加显微镜的分辨率：由于香柏油的折射率比空气和水的折射率要高，因此以香柏油为镜头与玻片之间介质的油镜所能达到的数值孔径要高于低倍镜、高倍镜等干镜。2、简单染色原理利用单一种染料对菌体进行染色的方法称为简单染色法。用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基 pH 下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚
3、果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。3、无菌操作技术原理高温对微生物具有致死的作用，因此在微生物的转接过程中，一般在火焰旁进行，并用火焰直接灼烧接种环，已达到灭菌目的，但一定要注意冷却后再进行转接，以免烫死微生物。如果转接液体培养物，则用预先已灭菌的玻璃吸管；如果只取少量而且无需定量也可用接种环，视实验目的而定。三、器材1、菌种：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） 、大肠杆菌(E.coli )和口腔细菌。2、染色剂：结晶紫染液或碱性复红。3、仪器或其他用具：显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、双层瓶（内装香柏油、二甲苯） 、擦
4、镜纸、生理盐水。四、步骤：1、涂片：取三块载玻片，分别滴一滴生理盐水于载玻片中央，用接种环以无菌操作技术分别挑取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌少许菌苔于水滴中（口腔中细菌用牙签从口腔中刮取） ，均匀并涂成薄膜。载玻片要洁净无油迹，取菌适量，涂片要均匀，不宜过厚。注意无菌操作。2、干燥：自然干燥。3、固定：涂面朝上，通过火焰23次。热固定时温度不宜过高，否则会改变或破坏细胞形态。4、染色：滴加染液于玻片上，以刚好覆盖涂面为宜，染色1min。 5、水洗：用自来水冲洗，直至涂片上流下的水无色为止。水洗时不要直接冲洗涂面，水流不宜过急、过大，以免涂片薄膜脱落。6、干燥：自然干燥。7、镜检：涂片干后镜检。按照
5、先低倍镜后高倍镜再油镜的顺序进行。油镜的滴加方法为：在高倍镜下找到观察样品区域后，用用粗调节器将镜筒升高，然后将油镜转到工作位置。在待观察的样品区域加滴香柏油，从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心下降，使油镜浸在镜油中几乎与标本相接。调节照明使视野的亮度合适，用粗调节器使镜筒徐徐上升，直至视野中出现物像，并使用细调节器使其清晰准焦为止。油镜使用完毕后一定要将油镜镜头擦试干净。五、作业：1、用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片与物镜镜头间滴加香柏油的作用是什么？2、绘出在油镜下观察到的细菌形态图。3、思考题：（1）在进行涂片时应注意那些环节？（2）进行细菌制片时为什么要进行热固定？在加热固定时应注意
6、什么？（3）为什么要在制片完全干燥后才能进行油镜观察？（4）进行微生物制片时是否都需要进行涂片？为什么？（5）进行简单染色的目的及原理是什么？进行微生物制片时是否都需要染色？为什么？（6）根据你的实验结果，对细菌进行简单染色时，染色时间对染色效果有何影响？为什么？（7）你是否观察到金黄色葡萄球菌聚集成葡萄串状？试解释其形成原因。实验二细菌革兰氏染色法、芽胞染色和荚膜染色一、目的要求1、掌握革兰氏染色法。2、掌握芽胞染色法并观察芽胞的形态特征。3、掌握荚膜染色法并观察荚膜的形态特征。4、巩固显微操作技术及无菌操作技术。二、基本原理1、革兰氏染色原理革兰氏染色法能将细菌分为 G+菌和 G-菌，其原
7、因是这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。首先利用草酸铵结晶紫初染，所有细菌都会着上结晶紫的蓝紫色。然后利用卢氏碘液进行媒染处理，由于形成碘结晶紫复合物增强了染料在菌体中的滞留能力。之后用95%乙醇作为脱色剂进行处理时，两种细菌的脱色效果不同。革兰氏阳性细菌细胞壁肽聚糖含量高，壁厚且脂质含量低，肽聚糖本身并不结合染料，但其所有的网孔结构可以滞留碘结晶紫复合物，现在一般认为乙醇处理可以使肽聚糖网孔收缩而使碘结晶紫复合物滞留在细胞壁，菌体保持原有的蓝紫色。革兰氏阴性细菌细胞壁肽聚糖含量低，壁薄且脂质含量高，乙醇处理时脂质溶解，细胞壁通透性增强，原先滞留在细胞壁中的碘结晶紫复合物容易被脱洗下来，
8、菌体变为无色，用复染剂（番红）染色后又变成复染剂颜色（红色） 。2、芽胞染色原理芽胞染色法是根据细菌的芽胞和菌体对染料的亲和力不同，用不同的染料进行染色，使芽胞和菌体呈不同颜色而便于区别。芽胞壁厚、透性低，着色、脱色均较困难，当用弱碱性染料孔雀绿在加热的情况下进行染色时，此染料可以进入菌体及芽胞使其着色，而进入芽胞的染料则难以透出。若再复染（番红液） ，则菌体呈红色而芽胞呈绿色。3、荚膜染色原理荚膜是包围在细菌细胞外的一层粘液状或胶质状物质。 由于荚膜与染料的亲和力弱，不容易着色；而且可溶于水，易在用水冲洗时被除去。 所以通常用 (负染色法 )染色，使菌体和背景着色，而荚膜不着色，从而与菌体区
9、分开。 三、器材1、菌种：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、荚膜细菌。2、染色剂：革兰氏染色液 、孔雀绿染色液。3、器材：酒精灯、载玻片、显微镜、双层瓶（内装香柏油和二甲苯） ，擦镜纸、接种环，载玻片夹子、滴管等。四、实验步骤（一）革兰氏染色1、制片取活跃生长期菌种按常规方法涂片、干燥、固定。选择对数生长期的菌种，防止染色结果错误。2、初染滴加草酸铵结晶紫染液染色1min-2min 后倾倒去染液，水洗。3、媒染先用卢氏碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖1min，水洗4、脱色将玻片上的残留水用吸水纸吸去，在白色背景下用滴管滴加95%乙醇20s-30s 冲洗 ,当流出液无色时立即用水洗去乙醇。脱
10、色是革兰氏染色是否成功的关键，脱色不够造成假阳性，脱色过度造成假阴性。5、复染将玻片上的残留水用吸水纸吸去，番红染液染色2min，水洗，晾干。6、镜检低倍高倍油镜。（二）芽胞染色1、制片：按常规方法涂片、干燥、固定。选用适当菌龄的菌种，幼龄菌尚未形成芽胞，而老龄菌芽胞囊已经破裂。2、加热染色：向载玻片滴加数滴孔雀绿染色液覆盖涂菌部位，用夹子夹住载玻片在微火上加热至染液冒蒸汽并维持5min，加热时注意补充染液，切勿让涂片干涸。3、脱色：待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗直至水流无色为止。4、复染：用番红水溶液复染2min。5、水洗：用缓流自来水冲洗直至水流无色为止。6、镜检：低倍高倍油镜。（三）荚膜
11、染色1、推片：在载玻片一端滴一滴草酸铵结晶紫染液，无菌操作取少量菌体于其中混匀。另取一块载玻片作为推片，将推片一端与混合液接触，轻轻左右移动使混合液沿推片散开，之后以约30度角迅速向载玻片另一端推动，带动混合液在载玻片上铺成薄膜。玻片必须干净无油迹，否则混合液不能均匀铺开。2、水洗：用缓流自来水冲洗直至水流无色为止。3、干燥：室温自然干燥。4、镜检：低倍高倍五、作业1、绘图并说明显微镜下观察到的革兰氏染色鉴定结果、芽胞和荚膜的形态特征。2、思考题：（1）革兰氏染色是否成功，有哪些问题需要注意，为什么？（2）现有一未知菌，个体明显大于大肠杆菌，请你鉴别该菌是革兰氏阴性还是革兰氏阳性，如何确定你染
12、色结果的正确性？（3）为什么用老龄菌进行革兰氏染色会造成假阴性？（4）你认为革兰氏染色中哪步可以省略？在哪种情况下可以省略？（5）Gram 在对死于肺炎的患者肺部组织进行检查时，经过染色，某些细菌如肺炎球菌保持蓝紫色，肺部组织背景为淡黄色，为什么肺部组织细胞未被染成蓝紫色？实验四微生物的分离与纯化一、目的要求1、掌握倒平板的方法2、掌握分离纯化微生物的基本操作技术二、基本原理从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。平板分离法主要有平板划线分离法和稀释涂布平板法。后者除能有效分离纯化微生物外，还可用于测定样品中活菌数。三、器材1、土壤样品：从校园中采集的土
13、壤样品2、培养基：牛肉膏蛋白胨培养基、查氏培养基、高氏号培养基3、试剂和溶液：10%酚、1%链霉素、盛4.5mL 无菌水的试管、盛45mL 无菌水带有玻璃珠的三角瓶4、仪器：玻璃棒、吸管、无菌玻璃涂棒等四、操作步骤1、倒平板将三种培养基加热融化冷却至50左右，在高氏号培养基中加入10%酚数滴，查氏培养基中加入1%链霉素溶液（终质量浓度为30ug/mL ） ，混均匀后分别倒平板，每种培养基倒三皿。倒平板的方法：右手持盛培养基的三角瓶于火焰旁用，左手将棉塞轻轻拔出，瓶口保持对着火焰，然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹住棉塞，左手持培养皿，并在火焰旁打开皿盖，成一条缝，迅速倒入培养基约15mL，加盖
14、后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。2、制备土壤稀释液取土样5g，放入盛45mL 无菌水带有玻璃珠的三角瓶中，振摇约20min 使土样与水充分混合，使细胞分散。用一0.5mL 的移液管吸取0.5mL 土壤悬液加入盛4.5mL 无菌水的试管中充分混匀，此为10 -1稀释液，以此类推制成10 -2、10 -3、10 -4、10 -5几种稀释度的土壤溶液。悬液细胞密度适宜，混合均匀。3、涂布将上述每种培养基的平皿上标记10 -3、10 -4、10 -5三种稀释浓度，做三个重复。用0.1mL 移液管吸取稀释好的土壤悬液按标记分别准确加入，用无菌玻璃涂棒在培
15、养基表面轻轻涂布均匀。其方法是先沿一条直线来回推动，然后改变方向90度沿另一垂直线来回推动，再转动平板涂布边缘。4、培养查氏培养基和高氏号培养基的平板倒置于28温室培养35d，牛肉膏蛋白胨培养基的平板倒置于37温室中培养12d。实验五三大类群微生物的菌落形态比较和放线菌及霉菌的形态观察一、目的要求1、初步观察三大类微生物的群落形态特征。2、学会平板菌落计数的基本原理和方法。3、掌握放线菌和霉菌的形态特征。二、基本原理平板计数法是将待测菌液经适当稀释，涂布在平板上；经过培养后在平板上形成肉眼可见的菌落。统计菌落数根据稀释倍数和取样量计算出样品中细胞密度。由于待测样品往往不易于分离成单个细胞，平板
16、上形成的单个菌落不一定是由单个细胞繁殖而成，有的可能来自两个或多个细胞，因此，平板计数的结果往往比样品中实际细胞数低，这就是现在使用菌落形成单位取代以前用绝对菌落数来表示样品中活菌含量的原因。三、器材1、菌种：青霉、曲霉、上次课分离纯化的微生物。2、染液：乳酸石炭酸棉蓝染液。3、各种装片四、实验步骤1、三大类微生物菌落形态比较观察上次实验课分离得到的细菌、放线菌、霉菌，从菌落含水状态、外观状态、菌落透明度、菌落与培养基结合程度、菌落颜色、菌落正反面颜色差别、气味几个方面比较辨别三大微生物。2、平板菌落计数从每种培养基10 -3、10 -4、10 -5三种稀释浓度的平板中选出平板中菌落在5020
17、0的稀释浓度进行计数。按以下公式进行计算：每毫升样液中菌落形成单位数（cfu）= 同一稀释浓度的平均菌落数*稀释倍数*10平均菌落数在五十左右最好。3、放线菌及霉菌的装片观察4、霉菌的制片观察滴一滴乳酸石炭酸棉蓝染液于载玻片上，用镊子分别取青霉和曲霉，先放在50% 的乙醇中浸一下洗去脱落的孢子，然后置于染液中，用解剖针小心将菌丝分开，去掉培养基，盖上盖玻片，在低倍镜和高倍镜下观察。注意无菌操作，取菌时要带下一些培养基，盖片时要将培养基分离出去，制片要薄。五、作业1、平板计数结果.2、绘制根霉的形态和构造，青霉和曲霉分生孢子头的结构。实验六酵母菌的形态观察、死活细胞的鉴别和显微镜直接计数一、目的
18、要求1、观察酵母菌的形态及出芽生殖方式，学习区分酵母菌死活细胞。2、学习并掌握使用显微测微尺测定微生物大小的方法。3、学习并掌握使用血细胞计数板测定微生物细胞数目的方法。二、实验原理美蓝染液有两种形式，其氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母菌进行染色后，由于活细胞体新陈代谢力强，染料进入细胞后，细胞可将氧化型美蓝还原为无色的还原型，由此区分酵母菌的死活细胞。微生物大小的测定需要借助特殊的测量工具显微测微尺，它包括目镜测微尺和镜台测微尺两个相互配合的部件。镜台测微尺是一个在特制载玻片中央封固的标准刻尺，其总长度为1mm 精确的分为10个大格，每个大格又分为10个小格，共100个小格，每一小个长
19、度为0.01mm，即10m 镜台测微尺并不直接用来测定微生物的大小，而是用来校正目镜测微尺每一小格的相对长度。目镜测微尺是一块可放入接目镜内的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度，一般等分为50小格和100小格两种。测量时，需将其放在接目镜的隔板上，用于测量经显微镜放大后的细胞物像。由于不同的显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，目镜测微尺每小格在不同条件下所代表的实际长度也不一样。因此用目镜测微尺测量微生物大小时，必须先用镜台测微尺进行校正，以测定该显微镜在一定目镜和物镜的组合下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。然后根据微生物细胞相当于目镜测微尺的格数，即可计算出细胞的实际大小。转换公式
20、如下：用血细胞计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。该计数板是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各列有一个方格网，每个方格网共分为九个大方格，中间的大方格即为计数室。血细胞计数板计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格；另一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格，但无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400个。每一个大方格边长为lmm。则每一个大方格的面积为 lmm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.lmm，所以计数室
21、的容积为0.lmm 3(1/10000ml)。计数时。计数时求出每一小格的平均值，然后通过公式，得到 lmL 菌液中的总菌数。设每个小格的平均菌数为 A，菌液稀释倍数为 B，则总菌数/ml = 410 6AB 三、器材1、菌种：酵母菌悬液。2、仪器：目镜测微尺、镜台测微尺、血细胞计数板等。3、染液：0.1%美蓝染色液。四、实验步骤1、酵母菌的形态观察取一滴酵母菌悬液于载玻片中央，在悬液上滴加一滴美蓝染液混匀，盖上盖玻片，在低倍镜和高倍镜下观察。2、酵母菌大小的测定把目镜上的透镜旋下，将目镜测微尺轻轻放在目镜的隔板上，使有刻度的一面朝下，然后放回到镜筒内。将镜台测微尺放在显微镜的载物台上，使有刻
22、度的一面朝上。先用低倍镜观察，调焦距，待看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度相平行，并使两尺左边的一条线重合，向右寻找另外一条两尺相重合的直线。校准目镜测微尺，根据公式计算目镜测微尺每格长度，卸下镜台测微尺，换上酵母菌装片，测定酵母菌的大小。测量完毕后取出目镜测微尺，将目镜放回镜筒，并将目镜测微尺和镜台测微尺分别用擦镜纸擦拭干净，放回盒内保存。校准目镜测微尺每格长度和测定酵母菌大小要在相同的放大倍数下进行。光线不宜过强。3、酵母菌计数在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗并吹干。将洁净的血细胞计数板盖上盖玻片，用无菌的毛细滴管将摇匀的酵母菌悬液由盖
