艾滋病常用实验室检测及临床意义分析.ppt

1、艾滋病常用实验室检测 及临床意义分析 广西疾病预防控制中心 梁富雄 2013.4 主要内容 n HIV抗体检测 n CD4检测 n 病毒载量检测 n 实验室安全防护 HIV抗体 - 感 染 成 功 抗 体 转 阳 诊 断 艾 滋 病 死 亡 - 4-8周 - 出 现 症 状 2-10 年 1年 0.5-2年 HIV抗体 + 无症状 有症状 HIV抗体 +艾滋病 感染艾滋病毒后的自然发展过程 急性感 染期 潜伏期 发病期 艾滋病感染者 艾滋病患者窗口期 1 2 3 4 急性感染期 KINETICS OF VIRAL MARKERS DURING PRIMARY HIV-1 INFECTION H

2、IV RNA HIV p24 antigen HIV antibodies HIV感染后血液中核酸、抗原和抗体动态变化 窗口期 暴露 天数 检测域 感染感染 HIV后病毒载量、后病毒载量、 CD4与病程变化规律与病程变化规律 中国 HIV实验室网络 国家艾滋病参比实验室 中国 CDC性艾中心 艾滋病确认中心实验室 省、市 艾滋病确认实验室 省、市 艾滋病筛查中心实验室 省、市、州、县 艾滋病筛查实验室 省、市、州、县 艾滋病检测点 乡、镇 HIV实验室条件 n 人员 :经过专门技术培训 ,取得培训合格证 /上岗证 ; n 环境 :功能分区 ,符合生物安全二级要求 ; n 仪器设备 :按要求配备

3、， 满足检测要求。 实验室必须经过资质认证 /验收！ HIV病原体诊断 HIV抗体检测 艾滋病病毒抗原检测（ P24） HIV核酸检测 病毒分离 检测样品 n 血清、血浆 n 尿液 n 抗凝全血（ CBC、 CD4、 VL) n PBMC（外周血淋巴细胞） 样品的采集和处理 一、样品的采集 最常用的样品是血液，包括血清、血浆和全血 (抗凝 血 )。 唾液或尿液有时也可作为测试样品。常用样品的采 集方法如下： （一）采集样品应按临床采血技术规范及检测试剂盒要 求进行。 （二）采集标本时应注意安全，操作应戴双层手套。建 议采用真空采血管及蝶形针具，以免直接接触血液。 （三）血清样品采集：用注射器抽

4、静脉血 3 5ml，室温放置 1-2小时，待血液凝固或用 3000rpm离心 15分钟，吸出血清备 用。 （四）抗凝血样品采集 (免疫功能 CD4/CD8测定、血液常规 CBC测定、病毒载量）：用加有抗凝剂（ K3EDTA）的真空采血 管或试管抽取静脉血，反复轻摇，常温 6小时以内送达实验室 检测 CD4/CD8或 CBC后，再分离血浆和血细胞备用。 （五）血清或血浆样品应存放于 -20 ， 短期内（ 1周）进行检测的样品可存放于 2-8 。 （六）用于抗原和核酸检测的血浆和血细胞样品应 冻存于 -20 以下，进行病毒 RNA检测的样品如长期（ 3个月以上）保存应置于 -80 。 二、样品的运

5、送 （一）抗体检测实验室间传递的样品应为血清或血浆，血 液常规、 CD4和病毒载量等要求送抗凝血。样品应置于带 盖的试管内，试管上应有明显的标记，标明样品的编号 或受检者姓名、种类和采集时间。 （二）将试管放入专用带盖的容器内，容器的材料要易于 消毒处理。在试管的周围应垫有缓冲吸水材料，以免碰碎 。如果路程较远或气候炎热，应在 2-8 条件下运送。抗 凝血和抗体检测样品路程短可常温送检。包装内需附有送 检单。 （三）特殊情况下如需对个别样品进行复测，可以用特快 专递形式投寄，但必须将盛样品的试管包扎好，保证不会 破碎和溢漏。 三、样品的接收 （一）含有感染性样品的包裹必须在具有处理感染源设备

6、的实验室内由经过培训的工作人员打开，用后的包裹应进 行消毒。 （二）核对标本与送检单，检查样品管有无破损和溢漏。 （三）检查样品的状况，记录有无严重溶血、微生物污染 、血脂过多以及黄疸等情况。 （四）因特殊临床治疗导致自发荧光的样品不可用于荧光 方法测试。 HIV抗体检测的目的 n 诊断 确定个体 HIV感染状况，包括临床检测、自愿咨询检测、根据特殊需要 进行的体检等。 n 血液筛查 防止输血传播 HIV，包括献血员筛查和原料血浆筛查。 n 监测 了解不同人群 HIV感染率及其变化趋势，包括各类高危人群、重点人群 和一般人群。 HIV抗体检测的方法 n 筛查试验（包括初筛和复检）：酶联免疫吸附

7、试验（ ELISA)、化学发光试验、明胶颗粒凝聚试验（ PA）、免疫 渗滤试验、免疫层析试验等 n 确证试验：免疫印迹试验（ WB)、条带免疫试验、放射免 疫沉淀试验、免疫荧光试验等。 艾滋病抗体确证试验 免疫印迹法（ WB）为目前最常用的 HIV抗体确认方法 ，被公认为判断 HIV感染的黄金方法。 艾滋病抗体检测试剂使用条件 HIV筛查或确认试剂必须是 HIV/1+2混合型，国家卫生 部批准或注册，经过国家医药监督管理局批批检合格，临 床试剂评估优良，并且在有效期内。 检测要点 1、严格按照试剂说明书操作，不得擅自更改。 2、注意防止交叉污染。 3、严格遵守实验室操作规程。 4、认真做好实验

8、记录。 HIV抗体检测结果及结论 HIV抗体筛查结果阴性反应可做 HIV抗体阴性报告， 筛查试验呈阳性反应，可出具 “ HIV抗体待复查 ” 报告， 不能出 HIV抗体阳性报告 。筛查阳性反应或可疑阳性反应 不能作最终报告通知被检测者，对个体诊断来说 ,只有经 过确证试验，结果阳性才可做 HIV抗体阳性报告。 检测程序及流程图 1、筛查检测 验收标本，用筛查试剂进行检测，如呈阴性反应，报告 HIV 抗体阴性；对呈阳性反应的标本，须进行重复检测。 2、重复检测 对筛查呈阳性反应的标本用原有试剂和另外一种不同原理 或不同厂家的试剂重复检测。 HIV抗体筛查检测流程 样样 品品 初筛检测初筛检测 筛

9、查试剂筛查试剂 阳性反应阳性反应 阴性反应阴性反应 重复检测重复检测 原有试剂和另外一种不同原理原有试剂和另外一种不同原理 （或厂家）的试剂，或另外两（或厂家）的试剂，或另外两 种不同原理或不同厂家的试剂种不同原理或不同厂家的试剂 一阴一阳一阴一阳 均阴性反应均阴性反应均阳性反应均阳性反应 送确认实验室确认送确认实验室确认 报告阴性报告阴性 HIV抗体确证 1、常用的确证实验方法是免疫印迹法（ WB）。 2、免疫印迹试剂有 HIV-1/2混合型和单一型。一般先用 HIV-1/2混合型试剂进行检测，如果呈阴性反应，则报告 HIV抗体阴性，如果呈阳性反应，则报告 HIV-1抗体阳性， 如果不满足阳

10、性标准，则判为 HIV抗体不确定。如果出现 HIV-2型的特异性指示条带，还需要用 HIV-2型免疫印迹试 剂再做单一的 HIV-2型抗体确认试验，呈阴性反应，报告 HIV-2抗体阴性；呈阳性反应的则报告 HIV-2抗体血清学阳 性。 HIV抗体确证检测流程 免疫印迹法（免疫印迹法（ WB ， HIV-1/2混合型）混合型） HIV-1阳性反应阳性反应 不确定反应不确定反应 出现出现 HIV-2指示条带指示条带 报告报告 HIV-1阳性阳性 结合流行病学资料，可以在结合流行病学资料，可以在 4周后随访检测，如带型没有进展或呈阴性反应，则报告阴性；如随访期间出现阳性反应，则报周后随访检测，如带型

11、没有进展或呈阴性反应，则报告阴性；如随访期间出现阳性反应，则报 告阳性；如随访期间带型有进展，但不满足阳性标准，应继续随访到告阳性；如随访期间带型有进展，但不满足阳性标准，应继续随访到 8周。如带型没有进展或呈阴性反应则报告阴性；满足周。如带型没有进展或呈阴性反应则报告阴性；满足 HIV抗体阳性诊断标准则报告阳性，不满足阳性判断标准可视情况决定是否继续随访。抗体阳性诊断标准则报告阳性，不满足阳性判断标准可视情况决定是否继续随访。 阴性反应阴性反应 报告阴性报告阴性 筛查试验阳性反应样品筛查试验阳性反应样品 根据具体情况进一步检测根据具体情况进一步检测 HIV-2 检测结果的报告和处理 HIV抗

12、体筛查： 筛查实验呈阴性反应出具 HIV抗体阴性报告，如果近 期有高危行为，如性乱、注射毒品等，或有急性流感样 症状等情况，为排除 “ 窗口期 ” 的可能，建议 23 个月 以后再做抗体检测。 筛查实验呈阳性反应，可出具 “HIV 抗体待复查 ” 报告 ，不能出阳性报告。 HIV抗体筛查呈阳性的处理 （ 1）填写 HIV抗体筛查阳性送检单 （ 2）尽可能重新采集受检者的血样。 （ 3）将二份血样（或仅原血样）连同 HIV抗体筛查阳性送 检单一并送当地艾滋病筛查中心实验室，再转送艾滋病确 认实验室，或直接送确认实验室确认。 （ 4）筛查中心实验室应尽快进行复测。 （ 5）做好检测后咨询。 HIV

13、抗体确证结果报告 1、 HIV抗体阳性应出具 HIV抗体阳性确认报告，并按相关 规定做好咨询、保密和报告工作 ; 2、 HIV抗体阴性应出具 HIV抗体阴性确认报告，如果近期 有高危行为，如性乱、注射毒品等，或有急性流感样症状 等情况，为排除 “ 窗口期 ” 的可能，建议 1个月以后再做 抗体检测 ; 抗体确证不确定结果 HIV抗体不确定出具 HIV抗体不确定确认报告，在 备注中应注明 “1 个月后复查 ” 。 1、随访：每 1个月一次，连续 2次，共 2个月。 2、做好检测后咨询。 全国艾滋病检测技术规范2009版 全国艾滋病检测技术规范2009版 实验室记录要求 1、标本的登记 收到标本后

14、，及时登记有关参数，包括受检者姓名或 代号、试管编号、性别、年龄、职业、送检单位、人群类 别、检验结果、送检日期、报告日期、备注 ( 必要时记录 通信地址 )等。 2、 实验原始记录表 应按实验要求，设计操作的原始记录表，标明空白对 照、阳性对照、阴性对照、外部对照以及待检样品的位置 ，便于指导实验人员加样。要注明试剂盒来源、测定方法 、批号、有效期、操作人员和复核人员姓名及检测日期。 3、 HIV 阳性标本的保存记录 记录 HIV阳性标本的储存量、储存温度、储存起始时 间以及标本保管人姓名。 4、文件存档 实验原始记录表、打印数据、检测记录表、标本登 记、标本保存记录以及仪器设备维修和校准记

15、录等都 应该妥善存档保存 15年以上。最好同时使用计算机保 存各种文件和记录。 HIV感染产妇所生儿童 HIV抗体 检测策略及流程 适用范围 HIV感染产妇所生婴幼儿；已满 18个月的婴幼儿 ，其母亲 HIV感染状态不详，儿童出现 HIV相关临床 表现，临床怀疑 HIV感染的儿童。 HIV感染产妇所生儿童 HIV抗体 检测策略及流程 检测程序及结果报告 婴儿满 12个月进行第一次 HIV抗体检测。使用两种不同原理或不 同厂家筛查试剂进行抗体检测，两种筛查试剂检测结果均为阴性反应 ，报告 “HIV 抗体阴性（） ” ，可排除感染。检测结果出现阳性反 应（一种为阴性反应一种为阳性反应或两种均呈阳性

16、反应），不能排 除感染，应继续追踪随访，至儿童满 18个月时再次进行 HIV抗体检测 。 HIV感染产妇所生儿童 HIV抗体 检测策略及流程 检测程序及结果报告 婴儿满 18个月时应再次进行 HIV抗体检测。使用两种 不同原理或不同厂家筛查试剂进行抗体检测。两种筛查试 剂的检测结果均为阴性反应，报告 “HIV 抗体阴性（） ” ，可排除感染。检测出现阳性反应（一种为阴性反应一 种为阳性反应或两种均呈阳性反应），进一步进行确证试 验，根据确证试验的结果判断是否感染 HIV 。 HIV感染产妇所生儿童 HIV抗体 检测策略及流程 检测程序及结果报告 在发放检测报告的同时上报疫情； 做好检测后咨询。

17、 全国艾滋病检测技术规范 2009版 免疫功能（ CD4/CD8）的检测 T淋巴细胞分类 在 T淋巴细胞分类中， CD4代表 T辅助细胞而 CD8代 表 T抑制细胞和 T杀伤细胞。 CD4+T淋巴细胞是 HIV感染 的主要靶细胞，也是免疫反应的中心细胞； CD8+T淋巴 细胞是免疫反应的效应细胞。 T淋巴细胞分类 正常人的 CD4+T淋巴细胞约占总的 T淋巴细胞的 65%， CD8+T淋巴细胞约占 35%。人体感染了 HIV后，涉及的主要病 理过程就是免疫系统的损害，主要表现为： CD4+T淋巴细胞 的丢失，绝对数量的减少，同时 CD8+T淋巴细胞数量增加， CD4和 CD8的比例失调。因此

18、CD4+T淋巴细胞计数作为直接测 定免疫功能的方法，是提供 HIV感染病人免疫系统损害状 况最明确的指标。 CD4+T淋巴细胞正常值 CD4： 410-1590/mm3 CD8： 190-1140/mm3 CD4/CD8： 1 CD4+T淋巴细胞计数 意义 是艾滋病疾病分期、确定诊断、制定抗病毒治疗和预 防机会性感染方案的标准实验室指标，也是与病毒载量相 配合预测疾病进程的可靠指标。 CD4+T淋巴细胞检测意义 1、用于 HIV感染者的疾病分期：凡 CD4+T淋巴细胞 200/mm3或 CD4+T淋巴细胞的百分比 14%的 HIV 感染者可归入艾滋病。 CD4+T淋巴细胞检测意义 2、 判断

19、HIV感染者的临床合并症（各种机会性感染与 CD4+T淋巴细胞的相关性），如 CD4+T淋巴细胞 200/ mm3时 ，很容易发生卡氏肺囊虫肺炎；而巨细胞病毒感染和鸟分支 杆菌感染常发生于 CD4+T淋巴细胞 50/mm3的病人，极少见于 CD4+T淋巴细胞 100/mm3的病人。 CD4+T淋巴细胞检测意义 3、 帮助确定抗 HIV药物治疗及机会性感染预防性治疗的适应症 ，例如，当 CD4+T淋巴细胞 200/ mm3时，应给予抗卡氏肺囊 虫肺炎的预防性治疗； 4、抗 HIV药物疗效的重要判断指标。 成人及青少年艾滋病分期标准 （美国 CDC.1993） CD41000）提示感染发生的可能性

20、非常大。 2、窗口期辅助诊断 n 在窗口期抗原峰出现前后通常出现一个病毒载量的高峰， 通常此高峰高于发病时的血浆病毒水平，早期病毒 RNA测 定具有特殊的意义。 n 目前国际上正在尝试使用这种检测对采供血样品进行多个 样品混合后的 RNA检测以降低窗口期传播的残余危险度。 3、病程监控 n 由于 HIV感染发生后病毒载量的变化具有一定规律，并且 这种变化与疾病的进程有着密切的相关性。 n 通常在感染后无症状期内发生的临床症状很难与 AIDS发病 时的症状区别，病毒载量测定可以帮助医生判断一个刚发 生的症状是否与 HIV感染有关。 4、指导治疗方案及疗效测定n 并非在任何情况下感染者都应 该进行

21、抗病毒治疗，这不但是 经济上的原因，更重要的是在 于抗病毒药物的副作用和疗效 。通常在病毒载量达到一定水 平后（如 35000-50000拷贝 /毫 升）才具有良好的效果。 n 只有通过治疗后病毒水平的检 测才能确定治疗是否有效，通 常治疗后病毒水平降低 50%才被 认为临床有效。 1000 800 600 400 200 6 5 4 3 2 0 20 40 60 week HAART STI HIV-1 plasma RNA CD4+ T cell count HIV-1 plasma RNA CD4+ T cell count 5、预测疾病进程 n HIV疾病进程与病毒载量的关系 十分密切

22、，观察感染者病毒 RNA 水平可大致预测其发病的可能 。如右图所示，病毒载量与 6年 发病率的关系为： 30000时则为 80%。 两种方法检测病毒载量 （一） RT-PCR （二） NASBA EasyQ 病毒载量检测样品要求 n 血浆 n 样品量约 1毫升 n 样品要求保存低温保存（ -20 以下） n 冷冻运输 实验室网络 n 自治区 CDC确证中心实验室 n 柳州市 CDC确证实验室 n 梧州市 CDC确证实验室 n 贺州市 CDC确证实验室 n 龙潭医院确证实验室 n 桂林市 CDC确证实验室 3.12105 低于最低检测限（ 400拷贝 /毫升） 高于最高检测限（ 7.5105拷贝

23、 /毫升） RT-PCR病毒载量结果的报告三种情况 n 具体的一个数值（该值在 400- 7.510 5拷贝 /毫升） n 低于最低检测限（ 400拷贝 /毫升） n 高于最高检测限（ 7.510 5拷贝 /毫升） 1.6105 低于最低检测限（ 50拷贝 /毫升） 高于最高检测限（ 3.0106拷贝 /毫升） NASBA EASYQ病毒载量结果报告的三种情况 n 具体的一个数值（该值在 50 3.010 6拷贝 / 毫升） n 低于最低检测限（ 50拷贝 /毫升） n 高于最高检测限（ 3.010 6拷贝 /毫升） 注意事项 1、不同检测方法的结果不能直接比较，必须转 化为国际单位 RT-P

24、CR:1IU/ml=0.51copies/ml NASBA EASYQ:1IU/ml=1copies/ml 注意事项 2、检测结果低于最低检测限不能排除 HIV感染 3、病毒载量结果低于 1000copies/ml不进行耐药检测，只有大 于 1000copies/ml的病人才做耐药检测。 艾滋病检测实验室安全防护 一、建立安全制度 （一）实验室的设备、建筑和设施的安全性应通过专家 的评审。 （二）建立安全标准操作程序，该程序应适用于现有的 实验条件，并与实验室其他规章制度一致。 （三）无论是否发生意外事故，每年都要对安全标准操 作程序及其实施情况进行检查。 （四）制定意外事故处理预案。建立意外

25、事故的登记和 报告制度。 二、人员管理和培训 （一）人员管理 1、实验室主任应了解所有工作人员。在安排工作区域时 ，要根据人员的工作种类和所涉及的生物材料，对实验 室环境做安全检查。 2、新调入人员、外来合作、进修和学习的人员在进入实 验室之前必须经过实验室主任的批准。非实验室人员和 物品不得进入实验室。 3、严格执行实验室工作人员年度采血检测 HIV抗体和备 案制度，工作人员血清应长期保留。 （二）培训 1、所有工作人员必须经过 HIV检测技术和实验室安全培 训，包括上岗培训和复训，并接受实验室管理人员的监 督。实验室的安全责任人要对工作和环境的安全负责， 所有工作人员都有责任保护自己和他人

26、的安全。 2、必须告知新上岗人员实验室工作的潜在危险，进行安 全教育，直至有能力后方可单独工作。 三、安全保障措施 （一）个人保健 1、高标准的个人保健对于减少感染的危险性很重要。 皮肤受损、患病都会增加感染的危险。皮肤的伤口和擦 伤都应以防水敷料覆盖。 2、进实验室前要摘除首饰，修剪长的带刺的指甲，以 免刺破手套。 3、进入实验室应穿隔离衣，戴手套。如果接触物传染 危险性大，则应戴双层手套和防护眼镜。 4、脱去隔离衣，离开实验室前必须洗手。 5、严禁在艾滋病检测实验室内进食、饮水、吸烟和化 妆。 （二）带入和带出实验室的物品 1、对所有带入实验室的物品都应进行检查。含有测试样品的 包裹应在安

27、全柜或其他适当的装置内打开。 2、将 HIV测试样品转送其他实验室时，应防止对人员和环境的 污染。护送样品的人应明确接收地点和接收人，实验室负责人 或其指定的人员应及时确认样本已送达指定的实验室，被转入 安全位置并得到妥善处理。 3、污染或可能造成污染的材料在带出实验室前应进行消毒。 （三）减少利器的使用 1、尽量避免在实验室使用针头、刀片等利器，如果必 须使用在处理或清洗时，应采取措施防止刺伤或划伤 ，并应对用过的物品进行消毒处理。 2、最好不使用玻璃制品。 3、尽量使用安全针具采血，如蝶形真空针，自毁性针 具等，以降低直接接触血液和刺伤的危险性。 .应将用 过的针头直接放入坚固的容器内，消

28、毒后废弃。 （四） HIV消毒方法 实验室常用物品的消毒方法如下： 1、废弃物缸： 10%（ v/v）次氯酸钠（含 10， 000 mg/L有效 氯）。 2、生物安全柜工作台面和仪器表面： 70%乙醇。 3、溢出物： 10%次氯酸钠。 4、生物安全柜和实验室：甲醛蒸气熏蒸。生物安全柜： 25ml福尔马林（ 40%w/v甲醛）和等量水混合后放在一个蒸 发皿中使其在密封的生物安全柜中蒸发，保持至少 6小时 ，最好过夜。实验室：福尔马林和水加热沸腾，其体积根 据实验室的大小而定。 5、污染的台面和器具： 37%甲醛水溶液，也可以用过氧化 氢或过氧乙酸。 四、实验室事故处理 （一）紧急处理措施 发生意

29、外事故时，应立即进行紧急处理，根据具 体情况采用相应的方法。 1、皮肤针刺伤或切割伤：立即用肥皂和大量流水冲洗 ，尽可能挤出损伤处的血液，用 70%乙醇或其他消毒剂 消毒伤口。 2、皮肤污染：用水和肥皂冲洗污染部位，并用适当的 消毒剂浸泡，如 70%乙醇或其他皮肤消毒剂。 3、粘膜污染：用大量流水或生理盐水彻底冲洗 污染部位。 4、衣物污染：尽快脱掉污染的衣物，进行消毒处理。 5、污染物泼溅：发生小范围污染物泼溅事故时，应立即进行消 毒处理。发生大范围污染物泼溅事故时，应立即通知实验室主 管领导和安全负责人到达事故现场查清情况，确定消毒的程序 。 （二）事故登记： 主要内容有： 1、事故发生的时间、地点及详细经过。 2、暴露方式；受伤部位、伤口深浅、暴露程度；污染物 种类（培养液、血液或其他体液）以及其中含有 HIV的情 况。 3、处理方法和经过，包括专家或领导赴现场指导和处理 的情况。 4、是否采用暴露后药物预防，如果是，应详细记录用药 情况、包括首次用药时间、服药方案和毒副作用。 5、随访检测的日期、项目和结果。 （三）报告和检测 1、发生重大事故时，在紧急处理的同时要立即向主管领 导报告。同时抽血检测 HIV抗体，暴露一年内要定期检测 。 2、发生小型事故时可在紧急处理后立即将事故情况和处 理方法报告主管领导，检测同前。 谢谢！谢谢！