1、 如何进一步确定分枝杆菌菌种和如何进一步确定分枝杆菌菌种和 耐药性？耐药性？ 临床样本 是否需要分子诊断 ? 1) 是否有强的结核病临床症状 ? 2) 是否有严重的肺部感染 ? 进一步确定和药物 敏感检测 耐药性分子诊断 MTB及其耐药性诊断 结核菌阳性 ? Yes Yes Yes 培养阳 性？ Yes No Yes Not TB No 培养 (6-8 weeks) 镜检 镜检阳 性 ? No 等培养 结果 No 结核菌快速诊断方法 结核病快速诊断方法在临床诊断中的应用结核病快速诊断方法在临床诊断中的应用 结核分枝杆菌快速诊断方法结核分枝杆菌快速诊断方法 A）结核菌核酸扩增诊断试剂盒）结核菌核
2、酸扩增诊断试剂盒 i) Cobas Amplicor ii) AMTDT iii) Loop-mediated isothermal amplification B）基因分型方法）基因分型方法 C）实验室）实验室 PCR方法（方法（ In-house PCR/qPCR ） 结核菌分子诊断现状评述结核菌分子诊断现状评述 只有痰检阳性的病例才能得到满意的结果只有痰检阳性的病例才能得到满意的结果 商业化试剂盒：简便易用但很昂贵商业化试剂盒：简便易用但很昂贵 实验室实验室 PCR诊断方法诊断方法 : 相对比较便宜相对比较便宜 快速快速 主要问题：主要问题： 交叉污染交叉污染 需要严格的实验室设计和操作
3、管理需要严格的实验室设计和操作管理 PCR实验室工作平面图 试剂准备间（ Reagent Preparation Room） 样品准备间（ Specimen Preparation Room） 核酸扩增室（ Amplification Room） 产物分析间（ Product Analysis Room） 工作流程实验人员 耐药分子诊断方法耐药分子诊断方法 商业化试剂商业化试剂 芯片芯片 线条探针检测法线条探针检测法 实验室实验室 PCR扩增、测序扩增、测序 Hain GenoType MTBDR plus MTB ID RpoB katG inhA HK $300 per test 商业化试
4、剂 Line Probe assay Fluoroquinolines Aminoglycosides ethambutol MTBDRsl for second line drugs HK $ 500 per test 现有诊断试剂的局限性：现有诊断试剂的局限性： 经过小规模实验检验经过小规模实验检验 简单、使用方便简单、使用方便 昂贵（主要由欧美发达国家研制）昂贵（主要由欧美发达国家研制） 我国的需求：我国的需求： 简单、便宜、可在基层医院使用简单、便宜、可在基层医院使用 重大传染病防治科技重大专项等研究项目：快重大传染病防治科技重大专项等研究项目：快 速诊断试剂研究速诊断试剂研究 简单可
5、行的方法简单可行的方法 实验室实验室 PCR检测检测 PCR扩增扩增 rpoB基因基因 耐药相关的高度保守区耐药相关的高度保守区 （ RRDR），测序，检测突变位点。），测序，检测突变位点。 时间：时间： 1周周 意义：意义： 1）可快速检出约）可快速检出约 90利福平耐药利福平耐药 菌株，指导临床用药。菌株，指导临床用药。 2）提示）提示 MDR发生的可能性。发生的可能性。 206 1349 TCG(TTG) S(L) 531 3225 GCT(GCC) A(A) 823 C T Analysis of rpoB of RIF-R strains 126 1200 ACC(ACT) T(T)
6、 481 1349 TCG(TTG) S(L) 531 1508 TTC(TCC ） F(S) 584 3225 GCT(GCC) A(A) 823 C C T T 818 RIF-D (818 strain): ACT T TGT CCGC C H37Rv: .ACC TCGTTC.GCT Sequence position in Mtb: .1200bp1349bp.1508bp3225bp Protein: T(T)S( L) F( S) .A(A) Codon position in Mtb400.450.503742 Codon position in E.coli481 531.5
7、84823 小结：小结： MDR/XDR TB检测检测 MDR/XDR TB 检测程序及所需时间检测程序及所需时间 痰显微镜镜检痰显微镜镜检 : 1 day If + : DNA 扩增扩增 菌型鉴定菌型鉴定 耐药基因突变检测耐药基因突变检测 2 6 days If - : 培养（液体、罗氏培养基）培养（液体、罗氏培养基） 阳性（阳性（ 液体：液体： 2 3 周；罗氏：周；罗氏： 4 8周）周） 分子鉴定和耐药基因检测分子鉴定和耐药基因检测 2 6天。天。 同时做常规药物敏感实验作为标准对照同时做常规药物敏感实验作为标准对照 结核病诊断结核病诊断 细菌学诊断细菌学诊断 提高痰涂片镜检水平，及时发
8、现高传染性病人提高痰涂片镜检水平，及时发现高传染性病人 对镜检阳性标本进行对镜检阳性标本进行 rpoB 基因扩增测序，进行基因扩增测序，进行 快速药物敏感性诊断快速药物敏感性诊断 免疫学诊断免疫学诊断 抗原特异性抗原特异性 -干扰素检测，对潜伏感染及与其干扰素检测，对潜伏感染及与其 他疾病进行鉴别有一定的诊断价值。他疾病进行鉴别有一定的诊断价值。 血清学检测？血清学检测？ Vaccine Develompment 结核疫苗研究历史结核疫苗研究历史 Koch继继 1882年发现肺结核的致病菌结核分年发现肺结核的致病菌结核分 枝杆菌后，试图从结核杆菌培养介质中得枝杆菌后，试图从结核杆菌培养介质中得
9、 到的结核菌素作为疫苗，由于诱发强烈的到的结核菌素作为疫苗，由于诱发强烈的 迟发型变态反应，没获得成功。迟发型变态反应，没获得成功。 1906年年 Calmette和和 Gurin发现预先给小牛发现预先给小牛 喂养低毒力剂量的人型结核分枝杆菌对于喂养低毒力剂量的人型结核分枝杆菌对于 再次静脉注射致死剂量的人型结核分枝杆再次静脉注射致死剂量的人型结核分枝杆 菌具有保护作用。菌具有保护作用。 Calmette和和 Gurin分离培养牛结核分枝杆菌，分离培养牛结核分枝杆菌， 经过经过 200-235次传代，终于得到了具有免疫保次传代，终于得到了具有免疫保 护力的减毒的牛型结核分枝杆菌株护力的减毒的牛
10、型结核分枝杆菌株 Bacille Calmette Gurin，简称，简称 BCG，即卡介苗。，即卡介苗。 1921年年 7月对母亲是结核病患者的月对母亲是结核病患者的 120名新生儿名新生儿 通过口服途径实施了卡介苗接种，或得了较好通过口服途径实施了卡介苗接种，或得了较好 的免疫保护效果。的免疫保护效果。 30年代年代 Scandinavian 地区开始使用地区开始使用 BCG皮内注皮内注 射的途径进行免疫，提高了疫苗应用的安全性射的途径进行免疫，提高了疫苗应用的安全性 。 1974年年 BCG被纳入被纳入 WHO免疫扩大计划，全世免疫扩大计划，全世 界每年有近界每年有近 1亿的儿童接受预防
11、性免疫接种。亿的儿童接受预防性免疫接种。 新型结核疫苗新型结核疫苗 研究背景研究背景 近十几年来，结核感染发病率持续增高。近十几年来，结核感染发病率持续增高。 传统传统 BCG疫苗存在严重不足：疫苗存在严重不足： 新生儿接种新生儿接种 BCG可有效保护儿童不患严重的结可有效保护儿童不患严重的结 核感染，如粟粒性结核和结核性脑膜炎，但对核感染，如粟粒性结核和结核性脑膜炎，但对 成人肺结核几乎没有保护作用。成人肺结核几乎没有保护作用。 成人再次接种成人再次接种 BCG,没有增强免疫保护的作用没有增强免疫保护的作用 。 新型结核疫苗研究迫在眉睫。新型结核疫苗研究迫在眉睫。 Andersen p, N
12、ature Review Immunology, 2019; 3:656 Live Mycobacterium（ recombinant BCG etc） Subunit vaccine The strategy for tuberculosis vaccine development Cited from Agger EM. Vaccine, 2019; 21:7-14 Model of interaction between environmental Mycobacteria and BCG Sensitisation with environmental Mycobacteria bl
13、ocks the activity of the BCG vaccine but not subunit vaccines. 新型疫苗发展策略 Andersen p, Nature Review Immunology, 2019; 3:656结核活菌苗（重组 BCG ） 亚单位疫苗 （蛋白多肽； DNA疫苗；病毒载体 ） 新型结核疫苗类型新型结核疫苗类型 (一一 ) 其它减毒活疫苗其它减毒活疫苗 (二二 ) 重组重组 BCG疫苗疫苗 (三三 ) 亚单位疫苗亚单位疫苗 DNA/蛋白多肽蛋白多肽 /病毒病毒 (四四 )营养缺陷性疫苗营养缺陷性疫苗 (五五 )治疗性疫苗（治疗性疫苗（ DNA） 1.
14、 牛型分枝杆菌减毒活疫苗牛型分枝杆菌减毒活疫苗 BCG。 2. 田鼠分枝杆菌减毒活疫苗。田鼠分枝杆菌减毒活疫苗。 自然突变株，保护力和自然突变株，保护力和 BCG相当。相当。 已应用于临床实验。已应用于临床实验。 3. 通过基因敲除通过基因敲除 /突变人型结核杆菌突变人型结核杆菌 毒力基因，构建结核杆菌减毒毒力基因，构建结核杆菌减毒 活疫苗。活疫苗。 减毒活疫苗 减毒活疫苗减毒活疫苗 BCG 近近 80年历史的减毒活疫苗年历史的减毒活疫苗 BCG是目前仅有的预是目前仅有的预 防结核病的疫苗。防结核病的疫苗。 BCG来源于传代来源于传代 230代的牛分枝代的牛分枝 杆菌，一直被广泛用作预防结核病
15、的疫苗，但多年杆菌，一直被广泛用作预防结核病的疫苗，但多年 的应用发现的应用发现 BCG的两大特性的两大特性 : 1、极不稳定，地域性、极不稳定，地域性 极强，保护效果从高达极强，保护效果从高达 80%至某些地域的至某些地域的 0%，有，有 时甚至带来有害效果时甚至带来有害效果 ; 2、 BCG通常可有效保护新生通常可有效保护新生 儿及儿童免患初期疾病如结核性脑膜炎，而对青少儿及儿童免患初期疾病如结核性脑膜炎，而对青少 年及成人几乎不能提供阻止后期感染性肺结核发生年及成人几乎不能提供阻止后期感染性肺结核发生 的保护力。的保护力。 BCG似为一双刃剑，有时保护，而有时似为一双刃剑，有时保护，而有
16、时 毫无用处甚至有害。因此，毫无用处甚至有害。因此， BCG的免疫病理和毒力的免疫病理和毒力 问题仍待谨慎的研究和探讨。问题仍待谨慎的研究和探讨。 卡介苗免疫保护效果 BCG保护作用差异大的原因保护作用差异大的原因 BCG丢失了一些结核杆菌特异性抗原；丢失了一些结核杆菌特异性抗原； 环境分枝杆菌的作用，使环境分枝杆菌的作用，使 BCG在体内受到在体内受到 抑制，不能引起有效的免疫保护作用；抑制，不能引起有效的免疫保护作用； BCG株、剂量和接种方案存在差异；株、剂量和接种方案存在差异； 人群基因差异；人群基因差异； 结核杆菌基因差异。结核杆菌基因差异。 BCG所缺失的结核杆菌特异性基因组区域所
17、缺失的结核杆菌特异性基因组区域 引自 Mustafa AS. Molecular Immunology, 2019; 39:113 重组重组 BCG疫苗研究疫苗研究 重组 BCG疫苗的优点 n 优良的佐剂和安全的载体优良的佐剂和安全的载体 n 表达多个抗原表位表达多个抗原表位 n 诱导持续的免疫记忆和高水平诱导持续的免疫记忆和高水平 的细胞免疫应答的细胞免疫应答 综合各疫苗优势综合各疫苗优势 重组重组 BCG疫苗疫苗 安全的载体：以安全的载体：以 BCG为表达载体。为表达载体。 人型结核杆菌保护性抗原：人型结核杆菌保护性抗原： Ag85B 和和 ESAT-6， MPT64 等。等。 增强细胞免
18、疫反应的细胞因子：增强细胞免疫反应的细胞因子： IFN-r, IL-2, IL-12, G-CSF等。等。 构建重组构建重组 BCG疫苗示意图疫苗示意图 Aph pMV261/361 ESAT6Ag85b IFN oriE Phsp65 连接 酶切 BamH EcoR Hind 重组重组 BCG构建构建 策略策略 P P P Aph pMV261/361 oriE Phsp65 BCG 转化 rBCG pMV261（染色体外） 与 pMV361（染色体内） oriE attp intPhsp60 Aph MCS pMV361 Phsp60 Aph oriE oriM pMV261 MCS at
19、tP attL 标志 基因 int attR 选择标志 外源基因 P 整合表达载体 X分支杆菌 基因组 attB 整合、插入 X 切割、连接 选择 外源P pMV361整合入染色体示意图整合入染色体示意图 重组重组 Mtb RD1-2F9 BCG疫苗免疫疫苗免疫 保护活性增强保护活性增强 细菌清除率改变细菌清除率改变 saline BCG BCG:RD1-2F9 saline BCG BCG:RD1-2F9 重组重组 Mtb RD1-2F9 BCG疫苗免疫保护疫苗免疫保护 活性增强活性增强 脾脏组织观察脾脏组织观察 引自 Pym AS. Nature Medicine, 2019; 9: 53
20、3 重组 Mtb Ag85B BCG疫苗 (rBCG30) 免疫活性增强 DTH反应增强 引自 Horwitz MA. PNAS, 2000; 97(25):13853 rBCG30免疫保护性增强 体重变化 rBCG30 免疫 保护性增强 肺脏和肝脏组 织学观察 亚单位疫苗亚单位疫苗 结核蛋白结核蛋白 /多肽疫苗概述多肽疫苗概述 Koch治疗性疫苗实验治疗性疫苗实验 Peter Anderson 等发现等发现 结核杆菌培养基滤结核杆菌培养基滤 过蛋白（过蛋白（ CFP）一定程度上具有保护小鼠感）一定程度上具有保护小鼠感 染结核的能力。这促使人们开始研究有效染结核的能力。这促使人们开始研究有效
21、的亚单位疫苗。人们在早期培养滤液中发的亚单位疫苗。人们在早期培养滤液中发 现具有明显免疫原性的蛋白质：现具有明显免疫原性的蛋白质： Ag85复合复合 体和体和 ESAT-6。 结核蛋白质疫苗的难点在于免疫效率不够结核蛋白质疫苗的难点在于免疫效率不够 强和缺乏可用于人体的佐剂。强和缺乏可用于人体的佐剂。 应用于预防的研究已较多。但应用于结核应用于预防的研究已较多。但应用于结核 治疗的研究报道尚不多。治疗的研究报道尚不多。 结核杆菌分泌蛋白和细胞壁蛋白是亚单位结核杆菌分泌蛋白和细胞壁蛋白是亚单位 疫苗研究的主要对象。疫苗研究的主要对象。 结核培养滤液蛋白，尤其短期培养滤液蛋结核培养滤液蛋白，尤其短
22、期培养滤液蛋 白免疫小鼠，具有保护效果，并证实保护白免疫小鼠，具有保护效果，并证实保护 效力来源于效力来源于 CD4+T细胞。细胞。 从培养滤液中分离鉴定出有免疫原性的蛋从培养滤液中分离鉴定出有免疫原性的蛋 白质有：白质有： ESAT-6、 Ag85B、 Mtb8.4、 Mtb32A、 MPT64和一和一 38kD蛋白（蛋白（ PstS-1 ）等。其中）等。其中 Ag85B免疫原性被认为最强。免疫原性被认为最强。 近来的研究发现近来的研究发现 Ag85B和和 ESAT-6的融合的融合 蛋白免疫原性更强。蛋白免疫原性更强。 Mtb8.4具有较强的细胞免疫活性，免疫动物具有较强的细胞免疫活性，免疫
23、动物 证明它具有很强的免疫活性。证明它具有很强的免疫活性。 The antigens selected for TB vaccine Yin-Yang Model Zhang Ying, Clin Pharmacol Ther. 2019;82(5):595-600. Traditional model Resuscitation, Replication, growth, death, Dormancy ESAT-6 Ag85BMtb8.4 HspX Ag85B-MPT64（ 190-198） -Mtb8.4 (AMM) Ag85B-MPT64（ 190-198） -HspX (AMH) P
24、ersisters Reverts Dormant Replicating 30kD分泌蛋白 (Ag85)的免疫原性 T细胞增殖反应 引自 Sinha RK. Vaccine, 2019; 15: 689 亚单位疫苗的特点亚单位疫苗的特点 环境分枝杆菌存在使环境分枝杆菌存在使 BCG的预防保护作用大为降低的预防保护作用大为降低 ，此时亚单位疫苗具有较好的免疫保护力。，此时亚单位疫苗具有较好的免疫保护力。 免疫佐剂和细胞因子对疫苗的效应影响很大。免疫佐剂和细胞因子对疫苗的效应影响很大。 T细胞表位对于亚单位疫苗非常关键。疫苗通过特细胞表位对于亚单位疫苗非常关键。疫苗通过特 异性表位和特异性的异性
25、表位和特异性的 T细胞作用，分别激活细胞作用，分别激活 Th1和和 CTL。 可以作为治疗性疫苗。可以作为治疗性疫苗。 引自 Mustafa AS. Molecular Immunology, 2019; 39:113 T细胞表位 亚单位疫苗佐剂亚单位疫苗佐剂 亚单位疫苗需要有效的佐剂才能引起有效的免亚单位疫苗需要有效的佐剂才能引起有效的免 疫应答。传统的铝佐剂主要引起疫应答。传统的铝佐剂主要引起 Th2为主的免为主的免 疫应答，显然不适合以细胞免疫为主的抗结核疫应答，显然不适合以细胞免疫为主的抗结核 疫苗。疫苗。 理想的结核疫苗佐剂所具有的功能理想的结核疫苗佐剂所具有的功能 : ( ) 免疫
26、调节免疫调节 ( ) 抗原呈递抗原呈递 ( ) 诱导诱导 CTL反应反应 ( ) 靶向特异性细胞靶向特异性细胞 ( ) 持久释放持久释放 抗原位置决定它们被呈递给不抗原位置决定它们被呈递给不 同的同的 T 细胞细胞 寻找有效的佐剂寻找有效的佐剂 寻找有效的佐剂是结核亚单位疫苗发展要寻找有效的佐剂是结核亚单位疫苗发展要 解决的关键问题。解决的关键问题。 早在早在 1994年年 Andersen用不同的免疫佐剂和用不同的免疫佐剂和 结核杆菌短期培养滤液蛋白结合，发现二结核杆菌短期培养滤液蛋白结合，发现二 甲基三十六烷基铵（甲基三十六烷基铵（ DDA）有较强的细胞）有较强的细胞 免疫诱导活性，能诱导
27、免疫诱导活性，能诱导 CD4+ T细胞的增殖细胞的增殖 。 此后，他们发现单磷酸类脂此后，他们发现单磷酸类脂 A（ MPL） 和和 DDA的混合物能更好地增强小分子蛋的混合物能更好地增强小分子蛋 白白 ESAT-6以及以及 ESAT-6和和 Ag85B融合蛋融合蛋 白的免疫原性，增强他们的抗结核保护白的免疫原性，增强他们的抗结核保护 力。力。 最近他们发现了另一种更有效的免疫佐剂最近他们发现了另一种更有效的免疫佐剂 混合物：合成的索因子（混合物：合成的索因子（ cord factor） trehalose dibehenate和和 DDA的混合物可的混合物可 以有效激发以有效激发 Th1反应，
28、诱导强的免疫保护应反应，诱导强的免疫保护应 答，而没有明显的毒副作用。答，而没有明显的毒副作用。 对于疫苗的转运方式，学者尝试用微球对于疫苗的转运方式，学者尝试用微球 体来转运，并证明这对于达到一个以细体来转运，并证明这对于达到一个以细 胞免疫为主的并具有持久的免疫记忆力胞免疫为主的并具有持久的免疫记忆力 的反应是非常重要的。的反应是非常重要的。 微球体形式的疫苗有很多优点：微球体形式的疫苗有很多优点： 1）微球体）微球体 直径约直径约 1-10m，容易被树突状细胞等其它，容易被树突状细胞等其它 抗原呈递细胞所吞噬，从而将抗原通过抗原呈递细胞所吞噬，从而将抗原通过 MHC 类和类和 类分子呈递
29、给效应细胞；类分子呈递给效应细胞； 2） 包被于微球体的抗原，不易被酶降解而清包被于微球体的抗原，不易被酶降解而清 除，而是在一定时间内缓慢释放。除，而是在一定时间内缓慢释放。 Evans等将重组等将重组 Mtb8.4蛋白包裹入蛋白包裹入 PLG微微 球体，发现可以有效激发球体，发现可以有效激发 CD8+T细胞反应细胞反应 和抗体生成，所诱导的免疫反应强于蛋白和抗体生成，所诱导的免疫反应强于蛋白 与其它佐剂（如与其它佐剂（如 MPL）的效应，可达到）的效应，可达到 DNA疫苗的免疫效果。疫苗的免疫效果。 Evans JT. Vaccine, 2019; 22:1964 Mtb8.4 微球体刺激
30、脾细胞分泌 IFN- 胞内细胞 因子染色 显示 CD8+ IFN-+ T细胞被 激活 Trehalose dimycolate (TDM)和和 HSP65 DNA包裹入包裹入 PLG微球体极大地增强了疫苗微球体极大地增强了疫苗 的免疫效果。的免疫效果。 单一剂量 Hsp65-TDM-PLG微球 体诱导产生较强的免疫保护力 应用于结核亚单位疫苗的佐剂应用于结核亚单位疫苗的佐剂 佐 剂 蛋白疫苗 DNA疫苗 效果 DDA CFP + MPL CFP DDA+MPL ESAT-6, Ag85B + DDA+trehalose dibehenate ESAT-6, Ag85B + polystyren
31、e microsphere CFP + PLG microsphere Mtb8.4 + PLG microsphere+ TDM Hsp65 + 细胞因子增强亚单位疫苗的 免疫保护力 Construction of a fusion protein AMM (a) The translation product of AMM (Ag85BMPT64(190198)Mtb8.4) with the molecular weight of 46.7 kDa. (b) Purification of AMM produced in E. coli. AMM was purified from in
32、clusion bodies by NiNTA His Bind column. M, protein molecular weight marker; 13, washed with buffer C with pH 6.3; 4 and 5, AMM was eluted with buffers D and E with pH 5.9 and 4.5, respectively. Construction of fusion protein AMH Adjuvant for protein vaccine Dimethyl- dioctyldecyl ammonium bromide (
33、DDA) , one kind of cationic liposomes BCG polysaccharide nucleic acid (BCG PSN) BCG cells were sonicated and the suspension was mixed with double volume 45% phenol natrium aceticum. Then it was heated to 68 for 30 min, the supernatants was concentrated and double volume of frosty ethanol were added.
34、 The mixture was washed three times with ethanol and ethylether. At last the extracts were dissolved in saline (1 mg /ml) and cryodesiccated to powder. Ultraviolet absorption spectrum of BCG PSN. BCG PSN prepared was scanned by ultraviolet absorption spectrum from 190 nm to 360 nm. The scan showed t
35、hat BCG PSN adjuvant had special absorption at peak of 206 nm and 260 nm. BCG polysaccharide nucleic acid (BCG PSN) Preparation Protective efficacy of BCG priming -AMM boosting against H37Rv challenge in mice Lung Spleen * * * * p0.05 compared to Ag85B boost; * * p0.05 compared to PBS; * *p0.05 comp
36、ared to BCG Protective efficacy of AMM/AMH boosting * p0.05 compared to PBS; * p0.05 compared to BCG AMM boost AMH boost PBS BCG AMM+AMH boost Ag85B boost *p0.05 compared to PBS Pathology in vaccinated mice after the challenge of H37Rv Summary The fusion protein AMM/AMH induced more effective humora
37、l and cell-mediated immune responses in mice than Ag85B alone. Mice primed with BCG vaccination followed by boosting with AMM two times produced a stronger immune response and afforded a better protection against M. tuberculosis infection than mice immunized with BCG alone or BCG priming followed by boosting with Ag85B. Subunit vaccine combining multiple antigens from replicating and dormant stages improved BCG-primed protective efficacy against M. tuberculosis infection in mice. 现进入临床试验阶段的疫苗 Stefan H E Kaufmann, The Lancet, 2019 兰州大学结核病研究中心兰州大学结核病研究中心
