1、 重庆医科大学重庆医科大学 有有 机机 化化 学学 杨晓兰杨晓兰 ( 第六版第六版 倪沛洲）倪沛洲） 单击此处编辑母版标题样式 单击此处编辑母版副标题样式 * 2 第十六章 氨基酸、多肽 和蛋白质 vAmino Acids, Peptides and Protein 主要内容 v第一节 氨基酸 (Amino Acid) v第二节 多肽 (Peptides) v第三节 蛋白质 (Proteins) 第一节 氨基酸 (Amino Acids) v一、结构、分类与命名 v二、性质 v（一）物理性质 v（二）化学性质 (一 ) 氨基酸的结构 20 standard amino acids in pro
2、teins 一、结构、分类与命名 2、结构表示 vL-氨基酸L-甘油醛 (对照标准 ) S- L-半胱氨酸 R-半胱氨酸 (二 )分类 分 类 - COOH -NH2 氨基酸（数） 酸性氨基酸 2个 1个 2个 中性氨基酸 1个 1个 15个 碱性氨基酸 1个 2个 3个 * 骨 架 变 化 (二 )结构和命名 UV 特征吸收： l = 280 nm Acidic amino acidscontaining two carboxylic groups Basic amino acids containing two amino groups 必需氨基酸（ 8种 ） v 三字符： Val,Leu
3、,Ile, Thr, Met,Trp, Lys, Phe v 中文名： 缬、亮、异亮、苏、蛋、色、赖、苯丙 v体内不能合成，必需由食物提供的氨基酸。 修饰氨基酸的结构 L-胱氨酸 L-羟脯氨酸 L-羟赖氨酸 L-甲赖氨酸 非蛋白质氨基酸 v 定义：不参与构成蛋白质但却以各种形式分布于 植物、细菌和动物体内的这些氨基酸。 v 形式存在：以 游离 或 结合形式 存在的氨基酸。 包括： -氨基酸 -氨基酸 -氨基酸 -氨基酸 D-氨基酸 例子 非蛋白质氨基酸 氨基酸 作用 鸟氨酸 瓜氨酸 精氨酸的代谢中间体 -氨基丁酸 是谷氨酸的脱羧产物 脑内的重要神经递质 -丙氨酸 / 构成维生素泛酸的基 本成分
4、 D-丙氨酸 D-谷氨酸 / 细菌的肽聚糖的成分 D-赖氨酸 D-鸟氨酸 / 某些革兰氏阳性菌的 糖肽中的成分 二、性质 （ Properties ） v（一）物理性质 v（二）化学性质 1、酸碱两性与等电点 2、脱羧反应 (decarboxylation) 3、与 HNO2反应 4、与茚三酮 (ninhydrin)反应 5、成肽反应 1） 酸碱性 (acid-base properties) 氨基酸 既是酸又是碱 2） 易于水，不溶于非极性溶剂。 3） 固体熔点高（ 200-300 ） 4） 旋光性 (optical activity) 氨基酸的结构 存在形式： 氨基酸在结晶状态或在接近中性
5、的溶液中是以 两性离 子 (dipolar ion) 的形式存在的 ,是一种 内盐 (inner salt) （一）物理性质 （二）化学性质 v1、 酸碱性与等电点 (1)两性电离 Amino acids are ampholytes (两性电解质 ) 碱性电离 酸性电离 酸碱性 铵盐 羧酸盐 （ 2）氨基酸的电离平衡 v 在三种离子共同存在于一个平衡体系中 v 以哪种离子为主取决于氨基酸的结构和溶液的酸 碱度。 阳离子 两性离子 阴离子 等电点 (Isoelectric Point ， pI) 定义：在某一 pH 值下，氨基酸所带正电荷的数 目与负电荷的数目正好相等，即 净电荷为零 ， 该
6、pH 值为该氨基酸的 等电点 （ pI） 。 v 1、 amino acids 几乎全部以两性离子 I 的形式存 在（并伴以极少量的阳性离子 和阴性离子 ） v 2、氨基酸的溶解度最小 等电点时 （ 1）氨基酸结构的影响 氨基酸 pI 酸性氨基酸 4.0 中性氨基酸 5.06.5 碱性氨基酸 7.5 （ 2）溶液酸碱度的影响 pKa COOH : 2.2 pKb : 11.8 pKa NH3+ : 9.4 pKb : 4.6 pHPI 阳离子 两性离子 阴离子 氨基酸的电泳示意图 PH 精氨酸 丙氨酸 天冬氨酸 2 7 8.5 正电荷 /负级 正电荷 /负级 正电荷 /负级 正电荷 /负级 负
7、电荷 /正级 负电荷 /正级 正电荷 /负级 负电荷 /正级 负电荷 /正级 2、脱羧反应 (decarboxylation) 组胺 尸胺 - 氨基丁酸（ GABA） v- 氨基丁酸 v是由谷氨酸中 -羧基脱羧后转变而成 v是脑内存在的重要神经递质 L-谷氨酸 - 氨基丁酸 3、与 HNO2反应 v 根据放氮的体积，可测定氨基酸 和多肽的和多肽的 的含量。 此种方法称为此种方法称为 van Slyke 氨基氨基 氮测定法氮测定法 4、与茚三酮 (ninhydrin)反应 v 茚三酮 -氨基酸 蓝紫色 (Ruhemanns purple) 鉴别： - 氨基酸 5、成肽反应 v 二肽 (dipep
8、tide) 酰胺键或称肽键 例题与习题 现在有四个氨基酸：苯丙氨酸 pI=5.5、脯氨酸 pI=6.3、门冬 氨酸 pI=2.8和赖氨酸 pI=9.7，请问在以下 pH条件下进行电 泳，各氨基酸的主要存在形式是什么？在外电场作用下， 移向阳极还是阴极？ 苯丙氨酸 脯氨酸 门冬氨酸 赖氨酸 （ 1） pH=7.0 （ 2） pH=6.0 （ 3） pH=5.0 （ 4） pH=2.0 正 阴极 正 阴极 负 阳极 正 阴极 负 阳极 负 阳极 负 阳极 正 阴极 正 阴极 正 阴极 正 阴极 正 阴极 负 阳极 正 阴极 负 阳极 正 阴极 第二节第二节 肽肽 (peptide) 第十七章 氨基
9、酸、多肽和蛋白质 第二节 肽 肽 是氨基酸残基之间彼此通过 酰胺键 (肽键 )连接而成的一类化合物。其通式为： 氨基酸 氨基酸 二 肽 多肽分子中的酰胺键称为 肽键 (peptide bond), 一般为 -COOH 与 -NH2 脱水缩合而成。 肽也以 两性离子两性离子 的形式存在。 人民卫生电子音像出版社 32 二肽分子的两端仍存在着游离的 -NH3+ 和 -COO-, 因此它可以再与另一分子氨基酸脱水缩 合形成 三肽 ; 同样依次可形成 四肽 、 五肽 。 四肽 l十肽以下的称为 寡肽 （ oligopeptide） l大于十肽的称为 多肽 （ polypeptide） l肽中的氨基酸单
10、位称为 氨基酸残基 (amino acid residue) 第十七章 氨基酸、多肽和蛋白质 第二节 肽 上页 下页 首页邓健 制作 张鲁雁 审校 33 自然界存在多种肽类物质 青霉素 短杆菌肽 S 脑啡肽 Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu leucine enkephalin Tyr-Gly-Gly-Phe-Met methionine enkephalin 虽有环肽存在 , 但绝大多数的肽呈链状 , 称为 多肽链 l N-末端 (N-terminal end)： 保留游离 -NH2 的一端 , 也叫 氨基末端 ，一般写在肽链的左边。 l C-末端 (N-terminal end) :
11、 保留有 -CO2H 的一端， 也叫 羧基末端 , 通常写在肽链的右边。 l 肽链骨架 : 所有链状多肽都有一个共同的骨架 一、肽的结构和命名 上页 下页 首页人民卫生电子音像出版社 35 v 三肽 (tripeptide)。 v命名： 以 C-末端的氨基酸为母体，其它 氨基酸残基称氨酰 依次 命出。 v 丙氨酰半胱氨酰亮氨酸 v 缩写成：丙 -半胱 -亮 或 Ala-Cys-Leu v 简写成： A-C-L 思考题： Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu 与 Leu-Ala-Tyr-Gly-Ser 相同吗 ? 肽键平面 v 肽单元 （ -C-CO-NH-C-） v 特征： v （ 1） 肽
12、单元是平面结构 。 v （ 2） 肽键具有局部双键性质 。 v （ 3） 肽键呈反式构型 与 C-N键相连的 O与 H或两个 C原子之间一般呈较稳定的 反式构型。 Peptide Bonds 肽键的平面特征 二硫键（ Disulfide bond ） Disulfide Bonds(二硫键 ) 烫发的过程是一个旧二硫 键还原打开而后又氧化形 成新的二硫键过程 两性电离和等电点 脱羧反应 与亚硝酸反应 酰化反应 缩二脲反应 ，缩二脲反应被广泛用于肽和蛋白质 的定性和定量分析。 二、肽的性质 邓健 制作 张鲁雁 审校 42 v（ 1）氨基酸组分分析 （ 2）氨基酸顺序分析 三、肽结构的测定 （ 1
13、）肽中氨基酸组分分析 The number and kinds of amino acids 6 N HCl, heating at 100 oC for 24 h automated amino acid analyzer Amino Acids Analyzer （ 2）肽中氨基酸顺序分析 N- 端测序： Edman降解法：可用于自动测序 适用于 50肽 C- 端氨基酸残基的分析：羧肽酶 羧肽酶 是肽链外切酶（ exopeptidase） 它专门催化水解肽链末端（即 C-端）的肽键 。 羧肽酶 A水解断裂那些不是 Arg（精） 和 Lys（赖） 的 C-端氨基酸 羧肽酶 B只水解断裂 C-
14、端为 Arg或 Lys的氨基酸 多肽链的选择性水解 (酶法和化学法 ) 化学法 溴化氰水解法，选择性切割甲硫氨酸的羧 基所形成的肽键。 、采用重叠法 采用重叠法得出整个肽链的氨基酸顺序 Tyr-Lys- Glu-Met- Leu-Gly- Arg -AlaGly v 一个 9肽其组成是 2Gly、 Tyr、 Lys、 Arg、 Glu、 Met、 Leu、 Ala；用 DND-Cl 和羧肽酶法证明 N、 C两端分别为 Tyr和 Gly； v 用蛋白酶水解得一组肽片段，测得各片段的氨基 酸排列次序为： AlaGly 、 TyrLys 、 Glu-Met-Leu-Gly- Arg； v 若用化学水
15、解得另一组肽片段，各片段的顺序为 ： Tyr-Lys- Glu-Met， Leu-Gly- Arg -AlaGly 。 试推测该 9肽中氨基酸的排列顺序（一级结构） 四、生物活性肽 （ active peptide） v 定义：是指在生物体内存在并具有活性的一类肽类。 v 现有： 神经肽、脑啡肽、催产素、加压素、谷胱甘肽、多 肽生长因子、非蛋白质来源多肽 v 作用：在体内一般 含量较少，结构多样 ，却起着重要的生 理作用。 v 动物体内控制和调节代谢的激素（ hormone）、脑内的神 经递质（ neurotransmitter）、微生物中的一些抗菌素（ antibiotic）等都是肽类。 v
16、 生命科学中的某些重要课题的研究 v 例如 细胞分化、肿瘤发生、生殖控制以及某些疾病的病因 与治疗等 ，均涉及到 活性肽 的结构和功能。 第三节 蛋白质 v一、蛋白质的元素组成 v二、蛋白质的分类 v三、蛋白质的结构 v四、蛋白质的理化性质 一、蛋白质的元素组成 v 元素组成：碳 50 55，氢 8，氧 20 23，氮 13 19，硫 0 4 v 有些蛋白质还含有微量磷、铁、锌、铜、钼、碘等元素 v 其中 氮的含量 在各种蛋白质中含量都比较接近， 平均为 16 v 因此，只要测出生物样品中的含氮量，就可粗略计 算出其蛋白质的含量 v 每 1g氮相当于 6.25g蛋白质 （一）根据化学组成分类
17、1、单纯蛋白质 (simple protein) 组成：只由 -氨基酸 例如清蛋白、球蛋白、谷蛋白、精蛋白、硬蛋白等 2、结合蛋白 (conjugated protein) 组成：由 单纯蛋白质 和 非蛋白质 (常称为 辅基 )两部分 常见的辅基：核酸、糖、脂、磷酸及色素等 包括：核蛋白、糖蛋白、脂蛋白、磷蛋白和色蛋白 二、蛋白质的分类 （二）根据形状分类 1、球状蛋白质 (globular protein) 外形 :接近球状，溶解度较好 例如：酶、免疫球蛋白等 2、纤维状蛋白质 (fibrous protein) 外形 :类似细棒或纤维，一般不溶于水 例如：毛发中的角蛋白，结缔组织中的胶原蛋
18、白及 弹性蛋白等 （三）根据功能分类 1、活性蛋白质（ active protein） 此类是指在生命运动中一切具有生物活性的蛋白质和它们 的前体。 例如：酶、运动蛋白、运输蛋白、激素蛋白和防御蛋白等 2、 结构蛋白质（ structural protein） 此类是指担负保护或支持作用的蛋白质 例如：角蛋白、弹性蛋白和胶原蛋白等 三、蛋白质的结构 （一）蛋白质的一级结构 （ primary structure） v 蛋白质的一级结构是指 蛋白质中氨基酸残基之间的排列顺序 v 一级结构是蛋白质的 基本结构 v 其主要化学键是 肽键 ，又称 主键 v 例如，胰岛素 v 一级结构：由条 A链 (2
19、1肽 )和一条 B链 (30肽 )通过二硫键连 接而成，分子中共有三个二硫键 v 作 用：降低体内血糖含量 v 用 途：在临床上治疗糖尿病 人胰岛素分子的一级结构 由由 51个氨基酸残基组个氨基酸残基组 成成 A、 B 二条多肽链。二条多肽链。 A 链内有一链内二硫键链内有一链内二硫键 ， A 链与链与 B 链之间借链之间借 2 条二硫键相连。条二硫键相连。 人民卫生电子音像出版社 59 蛋白质二级结构（ secondary structure） v定义：是指多肽链的 主链骨架 在空间盘曲折 叠形成的方式，并不涉及侧链 R基团的构象 v形式： -螺旋、 -折叠层、 -转角和无规卷 曲等几种类型
20、 v维系主链构象稳定的最主要因素是 主链的羰 基 和 亚氨基 之间所形成的 氢键 （二）蛋白质的空间结构 (二级、三级和四级结构 ) 三级结构（ tertiary structure） v 定义：是蛋白质分子在二级结构基础上进一步盘曲折叠形成 的三维结构，是多肽链在空间的整体排布。 v 三级结构的形成和稳定主要靠侧链 R基团的相互作用，作用力 有以下几种： v （ 1）氢键 v （ 2）盐键 v （ 3）疏水作用力 v （ 4） Van der Waals力 v （ 5）二硫键 四级结构（ quaternary structure） v 四级结构：由 两条或两条 以上具有 三级结构的多肽 链通
21、过疏 水作用力、盐键等次级键相互缔合而成。 v 每一个具有三级结构的多肽链称为 亚基 （ subunit）。 v 在蛋白质分子中，亚基的立体排布、亚基间相互作用与接触 部位的布局称为四级结构（ quaternary structure）。 v 四级结构不包括亚基内部的空间结构 v 亚基：一般多为偶数 v 为 2 10个时，是较小的蛋白质 v 多的可达上千个 四、蛋白质的理化性质 v（一）蛋白质的两性电离和等电点 v（二）蛋白质的胶体性质 v（三）蛋白质的变性 v（四）蛋白质的沉淀 v（五）蛋白质的颜色反应 （一）蛋白质的两性电离和等电点 pH pI pH=pI pH pI 阳离子 电中性 阴离
22、子 （二）蛋白质的胶体性质 v 蛋白质的分子量：有的可达数千万 v 水中形成的颗粒直径： 1 lOOnm v 有胶体溶液的性质，不能通过半透膜 v 可用半透膜将蛋白质与小分子物质分离而得以纯化 v 这种方法称为 透析法 v 透析法 是实验或工业生产上提取和纯化蛋白质常用的方法 （三）蛋白质的变性 v 是指蛋白质 v 在某些 物理或化学 因素的作用下 v 其空间结构遭到破坏 v 致使 蛋白质生物活性丧失 和 理化性质改变 引起蛋白质变性的因素 v物理因素有：加热、紫外线照射、超声波和 剧烈振摇等 v化学因素有：强酸、强碱、有机溶剂、重金 属盐等 变性蛋白质 (denatured protein)
23、 v变性作用并不破坏蛋白质的一级结构 v变性蛋白质的表现： v首先是 失去生物活性 。 如血红蛋白失去运输氧的功 能，胰岛素失去调节血糖的功能，酶失去催化能力等 v其次是 各种理化性质的改变 。 如溶解度降低，易 于沉淀等。 变性蛋白质（ 2种） v1、可逆变性 v 当变性蛋白质去掉变性因素后，能恢复原有性 质，这种变性称为 可逆变性 或称 复性 v2、不可逆变性 胃蛋白酶 v加热到 80 90 v就失去其消化蛋白质的功能 v当把温度回调到 37 ，则其功能又可恢复 。 v目前很多蛋白质变性后尚不能复性，如机 体衰老时的蛋白质变性尚属不可逆过程。 变性作用的实际意义 v 一是 防止蛋白质激素、
24、酶、抗体、疫苗等活性 蛋白质在生产和保存过程中变性，以保持其生 物活性 v 二是变性原理可用于灭菌等 （四）蛋白质的沉淀 调节蛋白质溶液的 pH值至等电点 , 再加入适当的 脱水剂除去蛋白质分子表面的水化膜 , 可使蛋白质分 子聚集而从溶液中沉淀析出。 沉淀蛋白质的方法： l盐析 常用 (NH4)2SO4、 Na2SO4、 NaCl、 MgSO4等 l有机溶剂 常用甲醇、乙醇、丙酮等亲水性溶剂 l重金属盐 常用 Ag+、 Cu2+、 Pb2+ 等 l常用的酸 ： 苦味酸、钨酸、三氯乙酸、磺基水杨酸等 上页 下页 首页邓健 制作 张鲁雁 审校 76 1、盐析法 （ salting out） v
25、盐析法 是指加盐使蛋白质沉淀析出现象的方法。即， v 分段盐析法 是指调节盐浓度可使混合蛋白质先后析出的方法 。 v 常用的中性盐：硫酸铵、氯化钠等 v 原理：破坏蛋白质胶体周围的水化膜 v 中和了蛋白质分子的电荷 v 一般用盐析沉淀出来的蛋白质不变性。 v 血清中加硫酸铵至 50饱和度，则 球蛋白 先沉淀析出， 加硫酸铵至饱和，则 清蛋白 沉淀析出 2、加有机溶剂 v 有：乙醇、丙酮等 v 原理：由于这些溶剂对水的亲和力强于蛋白质分 子而破坏了蛋白质周围的水化膜，使蛋白质沉淀 v 在蛋白质的 pI时，加入这些溶剂则沉淀效果更好 3、加重金属盐 v 有：硝酸银、醋酸铅及氯化高汞等 v 原理：这
26、是因为蛋白质在 pHpI的溶液中带负 电荷，可与这些重金属正离子结合成不溶性的 蛋白盐而沉淀。 4、加生物碱试剂 v 有：苦味酸、三氯醋酸、鞣酸和磺柳酸等 v 原理：这是由于蛋白质在 pHpI的溶液中带正电 荷，可与这些有机酸根结合成不溶性的蛋白盐而 沉淀。 反应名称 试剂 颜色 作用基团 缩二脲反应 强碱、稀硫酸铜溶液 紫色或紫红色 肽键 茚三酮反应 稀茚三酮溶液 蓝紫色 氨基 蛋白黄反应 浓硝酸、再加碱 深黄色或橙红 色 苯环 Millon反应 硝酸亚汞、硝酸汞和 硝酸混合液 红色 酚羟基 亚硝酰铁氰化钠反 应 亚硝酸铁氰化钠溶液 红色 巯基 (五 ) 蛋白质的颜色反应 第四节 酶的化学
27、酶的定义 : 酶的结构特点 (4点 ) 酶的催化效能 (三点 ) 酶催化的立体专一性 蛋白组学蛋白组学 PS1平台平台 v Proteomics Solution I System SymBiot I 自动加样系统自动加样系统 MALDI TOF 质谱仪质谱仪 特点特点 v DE技术 v 借助反射镜使飞行长度增加到 2m，提高了质量分辩率和测量 结果的 准确性 v 反射镜校正了在离子源时离子的初始速度分布，减小了相同 质量的离子在动能上的差别 v Voyager-DE-PRO使离子通过反射镜后并在源后裂解 PSD进 行肽的测序，获得真实的 MS/MS数据 v 可通过碰撞诱导解离 (CID)来增
28、加裂解的程度，从而获得更多 的结构信息 v 包括操作和数据系统软件：自动调整仪器、采集数据、处理 数据、打印报告 应用应用 v 蛋白质精确分子量测定 v 差异表达蛋白样品的鉴定 v 重组蛋白药物的肽图分析 v 理论肽库构建及实际肽图比对分析 蛋白质精确分子量测定报告蛋白质精确分子量测定报告 Data Explorer software 肽指纹图谱报告肽指纹图谱报告 Data Explorer software PMF中的同位素峰中的同位素峰 AutoMS Fit 检索报告检索报告 操作流程图操作流程图 2D-GEL Image 样品制备 2D Gel 电泳 图象分析 差异点 MS鉴定 已知 未知！？
