1、第 9章 核酸探针标记 （ label of nuclei acid probe ） l 山东大学医学院免疫学研究所 l 张利宁 一、探针的类型 l 核酸分子探针是指用放射性核素或其他标记 物 标记 的、能与特定的靶分子发生 特异性 相 互作用的 DNA或 RNA片段 。 l 1 基因组 DNA探针：病毒 DNA等 l 2 cDNA探针；最常用 l 3 寡核苷酸探针： 10-50bp， 测序、点突变 l 4 RNA探针：稳定性高、特异性强，但 RNA极易 降解，不宜操作。 二、探针的标记物 l 理想的标记物：敏感度高；特异性强； 不影响探针分子的主要理化特性；标记 、检测方法简单、探针保存时间
2、长；对 环境无污染、对人体无损害；价格低廉 。 l 一）放射性标记物 l 二）非放射性标记物 （一） 放射性标记物 -放射性核素 l 利用放射性核素能产生射线的特性将 核素标记在核酸合成所必需的 NTP或 dNTP上，通过一定方法掺入到 DNA 或 RNA 中去制成探针，与待测的核酸杂 交后，核素产生的 或 射线可使底片感 光的特性，通过放射自显影的方法进行 检测。 l 产生 射线的核素： 32P、 3H、 35S l 产生 射线的核素： 125I 1、常用的放射性核素 l 1） 32P： 产生 射线，灵敏度高，分辨率强，是 最常用的放射性标记物，但半衰期短（ 14。 3天） ： 位和 位标记
3、。 l 2） 35S： 分辨率高、半衰期长（ 87。 1天）。敏感 度底 l O(S) O(S) O(S) l OH- P-O-P-O-P-O-CH2 O 硷基 l O O O H H(OH) 2、放射性标记物的优缺点 l 优点：灵敏度高： 0。 01pg l 特异性强 l 缺点：放射性污染 l 成本高、半衰期短，不能长期保 存 二）非放射性标记物 l 1、优缺点 l 优点：无放射性污染 l 成本低、操作简单 l 缺点：敏感性、特异性均低于放射性核 l 素 2、常用的标记物 l 1）生物素： 1-2pg l 生物素化核苷酸 ： bio-16-dUTP l bio-11-dUTP l 生物素化核
4、苷酸 -通过酶触反应掺入到 DNA 中去制成探针 -杂交 -抗生物素蛋白 -生物 素 -酶的复合物 加底物 显色 l 光敏生物素 ：生物素与光敏基团结合 -光敏 生物素 -光敏生物素与核酸探针混合 -在 强光的作用下 -光敏基团与核酸共价结合 - 生物素标记的 探针 生物素化的核苷酸和 光敏生物素 生物素 光敏基团 2）地高辛甙元 l Dig-dUTP-通过酶触反应掺入到 DNA 中去制成探针 -杂交 -加抗地高辛 -酶 的复合物 加底物 显色 l 灵敏度较高： 0.1pg l 特异性较生物素高 l 是较理想的非放射性标记物 三、探针的标记方法 l （ 一）缺口翻译法或切口平移法 l （ 二）
5、随机引物法 l (三）末端标记法 l （ 四） cDNA探针的标记 l （ 五） RNA探针的标记 （一）缺口翻译法或切口平移 （ nick translation） 限量 DNA酶 I DNA聚合酶 I+ 32P-dNTP 变性 32P部分标记的 单连 DNA片段 5 3 3 5 5-3外切酶和 5-3 内切酶 5 3 5 3 5 缺口翻译法的原理 l 限量 DNase I在待标记的双连 DNA的每 一条连上产生若干个单连缺口 l 利用 E.coli DNA多聚酶 I的 5-3外切酶的 活性和 5-3多聚酶的活性，在缺口处 5 末端每切除一个核苷酸，则在 3末端添 加一个核苷酸，以修补缺口。
6、 l 随着缺口在 5末端的移动修饰的核苷酸 就掺入到新合成的 DNA连中 缺口翻译法的特点 l 1）快速、简便、标记的探针均一、特 异性高 l 2）仅适用于较长的双连 DNA l 3） DNA多聚酶必须是 E。 Coli DNA多 聚酶的全酶 l 4） DNA酶 I的浓度一定要适宜 （ 二）随机引物法（ random priming ) l 随机寡核苷酸引物（ random primer)： 含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段 的混合物，可以与任意核苷酸序列杂交 ，起到聚合酶反应引物的作用 l E。 coli DNA聚合酶 I的 Klenow大片段（ 仅具有 5-3多聚酶的活性，而无外切酶 的
7、活性） 随机引物法标记的原理 l 变性后的探 针 DNA或 RNA与随机引物 混合 l 随机引物按碱基互补的原则与模板 DNA 的相应区域结合 l DNA多聚酶 I的 Klenow大片段即从引物 3-OH端开始合成互补 DNA连 l 反应中若加入修饰的 dNTP即可获得标 记的 DNA探针 5 3 3 双连 DNA变性 随机引物 Klenow大片段 32P-dNTP3 5 变性 随机引物标记法 随机引物法的特点 l 1）不但可用于双连 DNA的标记，而且 可用于单连 DNA和 RNA的标记 l 2）操作简单 l 3） 标记率高 (三）末端标记法 l 末端脱氧核苷酸转移酶法（ terminal
8、deoxynucleotide transferase) l 5DNA3OH+ -32 p-dNTP l 5_DNA_3(pdN)n +nPPi (焦磷酸） l T4多核苷酸激酶法（ method of T4 polynucleotide kinase) 末端转移酶 (三）末端标记法 l T多核苷酸激酶法（ method of T4 polynucleotide kinase) l 35OH + 32P-P-PA(ATP） l 5 32P+PPA T4多核苷酸激酶 三、探针的标记方法 l （一）缺口翻译法或切口平移（ nick translation） l （ 二）随机引物法（ random
9、priming ) l (三）末端标记法 l （ 四） cDNA探针的标记（反转录制备 单 l 连 cDNA探针） l （ 五） RNA探针的标记（体外转录的方 法） 第 10章 核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization) 基本原理：具有一定同原性的两条核酸单 连在一定条件下（适当的温度、离子强 度等），按硷基互补的原则，重新形成 双连 DNA的过程。 杂交的类型： 液相杂交：核酸电镜 固相杂交：膜固相印记杂交、组织细胞原 位杂交、菌落原位杂交 一、膜固相印记杂交 l （ 一）固相支持物的选择 l 、硝酸纤维素膜： l 在高离子强度下，具有较强的吸附单 连 DNA和
10、 RNA的能力： 80-100ug/cm2 l 、 尼龙膜：在低离子强度下，很强 的吸附单连、双连的 DNA或 RNA； 350- 500ug/cm2 （二）杂交的基本过程： l 变性 l l 杂交 l l l 洗膜 l l 杂交信号的检测 、变性（ Denaturation) l热变性： 95-100C , 5-10分钟 l碱变性： 0.5Mol/L NaOH ,30分钟 、杂交 （ hybridization) l 变性的单连 DNA按碱基配对的原则，在适 当 l 的条件下重新缔合形成双连的过程。 建立杂交条件需要考虑的因素 l ）离子强度： x SSC l ） 杂交温度：杂交反应在低于
11、Tm值 15 - 25 温度下进行 l 一般，探针长 500bp， G+C含量为 ， l 离子强度为 x SSC； 杂交液中不含甲 酰胺， Tm 值为 93。 4，杂交温度 68 ，含甲酰胺， Tm值为 68。 4 ，杂交 温度 42。 4 l ）减少非特异性杂交反应：预杂交 、洗膜 l 离子强度： 0.1x SCC l 洗膜温度：低于 Tm值 5-12 C 。 l 探针长 500bp， G+C含量 42%,离子强度 0.1xSSC, 不含甲跣胺， Tm值为 67 ，则洗膜温度为 55-62 . 4、杂交信号的检测 l ）放射性核素探针的检测：放射自显 影 l ）非放射性核素探针的检测 l 地
12、高辛标记探针的检测 l 生物素标记探针的检测 地高辛标记探针的检测 抗地高辛抗体碱性磷酸酶复合物 底物（ BCIP+NBT) 紫色的不 溶性化合 物 生物素标记探针的检测 l 过氧化物酶 底物 （ ） 抗 生物素蛋白 生物素 棕褐色不溶 性的化合物 （ 三）膜固相杂交的类型 l 、斑点及夹缝印迹杂交（ dot blot and slot blot)： 检测 DNA或 RNA（ 定性或半 定量） 、 Southern 印迹杂交 (Southern blot)： l 检测 DNA大小、存在状态 l DNA电泳 l l 变性 转膜 杂交 吸水纸 玻璃板 重物 滤纸凝胶 盐桥 Southern转印 3
13、|、 Northern印迹杂交 (Northern blot)： l 检测 RNA的大小和状态 l RNA电泳 转印 杂交 l 洗膜 显色 二、组织、细胞的原位杂交 l 用标记的核酸探针与组织切片或细胞涂 片中的核酸进行杂交并对其进行检测和 定位的方法 三、菌落与噬菌体斑的原位杂交 平皿 膜杂交 培养 第 11章 PCR技术的原理和应用 l PCR： Polymerase chain reaction l Mullis: 1983发明， 1993获诺贝尔奖 l Sarki:1985将 PCR用于镰刀红细胞贫血 的诊断。 l Erlich: 分离纯化了适用于 PCR的 Tag酶 一、常规多聚酶连
14、反应 l （ 一）原理： l PCR是体外酶促合成特异片段的 方法。由高温变性、低温退火及适当温 度延伸等几步反应组成一个周期，循环 进行，使目的得以迅速扩增。 l 变性 -退火 -延伸 -延伸 30-35循环 94 c 55 c 72c 5 3 5 3 变性 退火 延伸 第二循环 （二 ） PCR 的特点 l 。操作简单 l 。省时： 1-2 hr l 。 灵敏度高： pg l 。 特异性强 l 。对原始材料质量要求低 l 。有一定程度的单核苷酸错误掺入 （ 三）影响的因素 l 、模板： ng量的克隆 DNA或 g的染色 l 体 DNA l 、引物：特异性应强 l 、 Mg2+浓度 : 1.
15、5-2 mmol/L量 l 、 dNTP 的 浓 度 : 单核苷酸浓度 200umol/L l 5、 Taq DNA聚合酶的用量 :100l 反应液 l 中加入 2。 5U的酶 l 、循环参数：； 25-35 PCR引物的设计 l 、 上游引物 与目的 DNA 端序列完全相同 ； 下游引物 与目的 DNA 端序列互补 l 、引物长度以 15-30个碱基为益； l G+C含量为 45-55 l 、避免引物内形成二级结构 l 、两引物间不应发生互补，特别是在 端 ， l 避免形成引物二聚体 l 、合成的引物应进行纯化 l 、引物的浓度不要太高 : 0.1-0.5 mol/L 引物的设计 l 目的：
16、 ATG GGA AGC TGC TGT TAC CTC CGC ACT TCG GAC-CTC CTA AGA CAC TCT CTA CAG-3 上游序列： ATG GGA AGC TGC TGT TAC CTC G+C=11/21=52% 下游序列： CTG TAG AGA GTG TCT TAG GAG-3 G+C=10/21=48% 二、反转录 PCR （ Reverse transcription PCR ， RT-PCT) l反转录 PCR： mRNA-cDNA-PCR l抽提 RNA l反转录合成 cDNA lPCR 扩增 AAAAAAA-3 AAAAAAA-3 TTTTTTT
17、-5 mRNA cDNA TTTTTTT-5 PCR RT-PCR 反转录酶 +dNTP cDNA 三、荧光实时定量 PCR (fluorescence Quantified real time PCR) l实时荧光定量 PCR技术于 1996年由美 国 Applied Biosystems公司推出，由于 该技术不仅实现了 PCR从定性到定量 的飞跃，而且与常规 PCR相比，它具 有特异性更强、有效解决 PCR污染问 题、自动化程度高等特点，目前已得 到广泛应用。下面就其定量原理、方 法作一介绍 。 实时荧光定量 PCR原理 l 所谓实时荧光定量 PCR技术，是 指在 PCR反应体系中加入荧光
18、基团 ，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR进程，最后通过标准曲线对未 知模板进行定量分析的方法。 l 1. Ct 值的定义 C代表 Cycle（ 循环数） t代表 threshold（ 荧光域值） CT值的含义是：每个反应管内的 荧光信号到 达设定的域值时所经用 的循环数 Ct值的确定 横坐标： PCR循环数 纵坐标：荧光信号强度 黑线：荧光域值 红线：无模板 -域值下一 直线 绿线 ：样品 CT值 =17 （第 17个循环时， 荧光信号强度达到域 值） 2. 荧光域值（ threshold） 的设定 l PCR反应的前 15个循环的荧光信号作 为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置 是 3-1
19、5个循环的荧光信号的标准差的 10 倍，即： threshold = 10 SDcycle 3-15 3. Ct值与起始模板的关系 研究表明，每个模板的 Ct值与该 模板的起始拷贝数的对数存在线性 关系，起始拷贝数越多， Ct值越小 。 l 利用已知起始拷贝数的标准品可作 出标准曲线（如下图所示） 荧光定量标准曲线 l 横坐标代表起始拷 贝数的对数，纵坐 标 代 Ct值 . l 获得未知样品的 Ct 值 -标准曲线 -该 样品的起始拷贝数 。 4. 荧光化学 l 荧光定量 PCR所使用的荧光化学 可分为两种： l 荧光探针 l 荧光染料 1） TaqMan荧光探针 ： l 用 荧光基团标记 P
20、CR特异性荧光探针。 探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬 灭荧光基团。 l 探针完整时报告基团发射的荧光信号被淬灭基 团吸收 -检测不到荧光信号； l PCR扩增时， Taq酶的 5 3外切酶活性将探 针 酶切降解，报告荧光基团和淬灭荧光基团分离 荧光监测系统接收到荧光信号 l 每扩增一条 DNA链，就有一个荧光分子形成， 实现了荧光信号的累积与 PCR产物形成完全同 步。 TaqMan 荧光探针工作原理 2） SYBR荧光染料 l 在 PCR反应体系中，加入过量 SYBR荧 光染料； SYBR荧光染料特异性地掺入 DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链 中的 SYBR染料分子不会发射任
21、何荧光信 号，从而保证荧光信号的增加与 PCR产物 的增加完全同步。 传统定量 PCR方法： PCR ELISA法 l 内参照法；竞争法 ； l 原理：同一 PCR管（荧光标记引物、待检 模 板、已定量内标） -该 PCR管（扩增的模 板、扩增的内标） -电泳或高效液相分离 -分别检测荧光强度 -以内标为参照，定 量检测模板 缺点 -重现性差 l 传统定量方法都是终点检测（ PCR到达平台 期后进行检测），而 PCR经过对数期扩增到 达平台期时，检测重现性极差。 l 同一个模板在 96孔 PCR仪上做 96次重复实验 ，所得结果有很大差异（见图 4），因此无法 直接从终点产物量推算出起始模板量
22、。 l 加入内标后，可部分消除终产物定量所造成 的不准确性。但即使如此，传统的定量方法 也都只能算作半定量、粗略定量的方法。 l 图 4. 相同模板在同一 台 PCR仪上进行 96次 扩增的扩增曲线图 l 终点处检测产物量不 恒定； Ct值则极具重 现性 l 四、梯度 PCR 利用梯度 PCR仪对解链、退火及延伸 设置温度梯度，适用于摸索试验条件 时，多次试验可在一台仪器上完成， 既节省试验时间，提高效率，又节省 试验成本。 五、 巢式 PCR（ nested PCR ） 巢式 PCR（ nested PCR） 是一种 PCR改良模式 ，它使用巢式 PCR引物来增 强 反 应 的敏感性和 特异
23、性，巢式 PCR方法由两 轮 PCR扩 增和利用 两套引物 对 所 组 成，在第一 轮扩 增中，使用 一 对 外引物 产 生 扩 增 产 物，然后用一 对 内引 物 对 第一 轮扩 增 产 物 进 行第二 轮扩 增。以上 方法适用于多种 DNA及 RNA病毒的 检测 ，如 HBV DNA、 HCV RNA、 HIV RNA、 CMV DNA 、 HTLV DNA、 HGV RNA等。 长 PCR（ Long range PCR） 1.27 kb fragments are possible from good quality genomic DNA, 2.Taq DNA polymerase for high processivity (i.e. 5-3 polymerase activity) 3.usually Pwo with 3-5 proofreading abilities 4. This combination of features allows longer primer extension than can be achieved with Taq alone.
