1、基因操作技术的基本条件 C 用于基因转移的受体菌或细胞 B 用于 基因克隆的载体 A 用于核酸操作的工具酶 看书找答案 n 1、核酸酶分哪两种，有什么差别？ n 2、限制性核酸内切酶分几种，哪种最常用，为什么？ n 3、 DNA连接酶的作用是什么，哪两种较常用？ n 4、大肠杆菌 DNA聚合酶的种类和作用 n 限制性内切酶 主 要用于 DNA分子的特异切割 n 核酸连接酶 用 于 DNA和 RNA的连接 n 核酸聚合酶 用 于 DNA和 RNA的合成 nDNA甲基化酶 用 于 DNA分子的甲基化 n 核酸酶 用 于 DNA和 RNA的非特异性切割 A 用于核酸操作的工具酶 限制性核酸内切酶 一
2、、限制性核酸内切酶的发现及其生物功能 1968年， Smith等人首先从 流感嗜血杆菌 d株中分 离出 Hind II和 Hind III 一类能够 识别 双链 DNA分子中的某种特定核苷酸序 列，并由此 切割 DNA双链结构的核酸内切酶。切开 的是 3， 5磷酸二酯键。 n 核酸酶分为： 外切核酸酶 【 从一头开始，顺序切断 】 内切核酸酶 【 能识别特定序列切断 】 n 内切酶生理意义：分解外来 DNA，保护自身 DNA 二、限制性核酸内切酶的类型及其主要特性 特性 1. 限制修饰活性 2. 内切酶的蛋白 质结构 3. 限制辅助因子 4. 切割位点 5. 特异性切割 6. 基因克隆中 I
3、型 双功能的酶 3种不同亚基 ATP、 Mg2+和 S- 腺苷甲硫氨酸 距特异性位点 5 端至少 1000bp 不是（随机） 无用 II 型 限制酶和修饰酶分开 单一成分 Mg2+ 位于识别位点上 是 非常有用 III 型 双功能酶 2种亚基 ATP、 Mg2+和 S- 腺苷甲硫氨酸 特异性位点 3端 24-26bp处 是 用处不大 限制性核酸内切酶 三、限制性核酸内切酶的命名 属名 种名 株名 H i n d III H i n d III Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌 d株 分离顺序： 同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶 四、影响
4、限制性核酸内切酶活性的因素 1、 DNA样品的纯度： 加大酶的用量， 1 mg DNA 用 10U 酶 加大反应总体 积延长反应时间 限制性核酸内切酶 2、 DNA样品的甲基化程度： 3、核酸内切酶的缓冲液性质 与 II型核酸内切酶有关的几个概念 粘性末端 cohesive ends：指 DNA分子在限制酶的作用 之下形成的 具有互补碱基的单链延伸末端结构 ，它们能 够通过互补碱基间的配对而 重新环化 起来。 平 末 端 Blunt end： 在识别序列对称处同时切开 DNA 分子两条链，产生的平齐末端结构。则 不易于 重新环化 。 带 5 P端的黏性末端 带 3 OH 和 5 P端的平末端
5、（一） DNA连接酶的发现 首个 DNA连接酶 (ligase) 1967年， 大肠杆菌 DNA连接酶 ， 是大肠杆菌基因编码的 。 1970年，发现了 T4 DNA连接酶 ， 由大肠杆菌 T4噬菌体基因编码的。 二、 DNA连接酶 （二）常用的 DNA连接酶 E.coli DNA连接酶 ：连接具互补碱基黏性末端 (最初研 究表明），现在研究可连接平末端；需 NAD+辅助因子 ，活性低，不常用。 T4DNA连接酶 ：连接具互补碱基黏性末端和平末端， 需 ATP辅助因子，活性高，常用。 （三） T4 DNA连接酶连接反应的条件 影响连接效率的因素有： A. 温度（通常在 4-15 ） B. AT
6、P的浓度 (10M L - 1 ) C. 连接酶浓度（ 平端的连接比粘性末端的连接要困难得多，所需 的酶量也多 ，一般平末端大约需 1 2U， 黏性末端仅需 0.1U） D. 反应时间（通常连接过夜） E. 插入片段和载体片段的摩尔比（ 11 51） 三、 DNA聚合酶 n 催化合成 DNA的酶 n 特点：不能自行从头合成 DNA链，必须有一个 RNA引物 n 分类 : 大肠杆菌 DNA聚合酶 T4DNA聚合酶 T7DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶 反转录酶 （ 一 ） E.coli DNA聚合酶 1. E.coli 的 DNA聚合酶系统 Pol I 参与 DNA修复 ：具 35 和 5 3
7、 外切酶活 性 pol II 参与 DNA修复 ：具 35 外切酶活性 pol III 参与 DNA复制 ：具 35 和 5 3 外切酶活 性 2. E.coli pol 的特点 1）具两种外切酶活性和 DNA聚合酶活性 在蛋白酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的 片段，其 大片段 称为 Klenow片段 , 具 35 外切 酶活性 2） 聚合酶活性， 53, 要求 3-OH引物和模板 DNA 3） 外切酶活性 （二） T4 DNA聚合酶 1. 特点： 5 3 聚合酶活性； 35 外切酶活性 【 对单链 DNA强 】 2. 用途： 制备高比活性探针 （三） Taq DNA聚合酶 1. 特点： 分
8、离自水生栖热菌，分子量为 94,000，最适反 应温度 75 ， 对 95 高温具良好稳定性，该酶不存 在 3 5外切酶活性 2. 用途 主要用于 DNA的体外扩增，经 25次循环后才 进入酶的反应稳定期，一个 DNA 分子因而可被扩 增 4106倍 四、其它 DNA修饰酶 n 磷酸酶和 T4多聚核苷酸激酶 n DNA酶 （ DNase I） n RNA酶（ RNase） n 末端脱氧核苷酸转移酶（ TDT） 一、 DNase I 1. 特点： 具内切酶活性，但无核苷酸序列特异型，产生 5-P低 聚核苷酸 ; Ca2+ , Mg 2+ 或 Ca2+ , Mn2+可使酶活达最大值 2. 用途 1
9、) 切口移位 ，制备 DNA探针 2) 制备 RNA样品时除去 DNA分子 3) 基因突变时产生切口 ds-DNA结构 : 切口 , 缺口 , 断口 缺口 (gap) 切口 (nick) 断口 (cut) 3HO P5 3HO P5 Mn2+存在时 Mg2+存在时 DNaseI 作用特点 DNaseI HO P 5 3 5 35 3 DNaseI与 Pol I 的 切口移位 Pol I RNase n RNase H 作用于 DNA-RNA杂交分子中的 RNA链 ，用于 cDNA文库建立时除去 DNA链以便第 二条链 cDNA链的合成。 核酸修饰酶 末端脱氧核苷酰转移酶（ TdT） TdT的基
10、本特性：来自小牛胸腺 不需要模板的 DNA聚合酶， 随机掺入 dNTPs 5 p 3 HO OH 3 p 5 TdT Mg2+ dATP 5 p 3 HO AAAAAAAAAAAA OH 3 p 5 外源基因不易自己进入细胞 进入后不能自我复制 二、什么是载体（二、什么是载体（ vector ）？）？ 携带 外源目的基因； 进入 宿主细胞； 进行 扩增和表达的具有运载能力的 DNA 三、分类 克隆载体 【 扩增 】 ；表达载体 【 表达外源基因 】 一、为什么要用载体？一、为什么要用载体？ B 用于基因克隆的载体 四、作为载体的四、作为载体的 DNA分子必须具备条件：分子必须具备条件： 1.有
11、复制子，至少有一个复制原点，能自主复制 或整合到染色体 DNA上随其复制而同步复制。 2.有 1至多个克隆位点，供外源 DNA片段插入载体 DNA分子。 克隆位点 【 外源 DNA进来的座位 】 克隆位点就是限制酶的识别位点 【 方便剪开载体，和外源 DNA粘到一起 】 A、一个载体，一 种限制酶识别位 点只有一个 B、位点都在非必 需区，剪开也不 影响载体本身的 复制。 3.必须具有用于选择克隆子的标记基因 （ 1） 抗性标记基因 ：抗生素抗性、重金属抗性 (Cur ， Znr ) 、代谢抗性 (TK，抗除草剂基因 ) （ 2） 营养标记基因 :主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需 营养物合成
12、酶类的基因 （ 3） 生化标记基因 (其表达产物可催化某些易检测的生化反 应，如 lacZ) 常用的遗传标记基因 1) 氨苄青霉素抗性基因（ Ampr） 2)四环素 抗性基因 （ Tetr） Ampr抗性基因编码一种 -内酰胺酶，可特异地 切割 Amp的 - 内酰胺环，从而使其失去杀菌能力 五、载体的种类五、载体的种类 根据来源可分为： 质粒载体 噬菌体载体 大分子 DNA克隆载体 病毒载体 （ 一）质粒载体 大多是在天然松驰型质粒的基础上经人 工改造拼接而成，是应用最广的载体。 质粒 质粒的基本特征 质粒是能独立于寄主染色体而自主复制、 并被稳定遗传的一类核酸分子 质粒常见于原核细菌和真菌中
13、 绝大多数的质粒是 DNA型的 绝大多数的天然 DNA质粒具有共价、封闭、环状的分 子结构，即 cccDNA 质粒 质粒的基本特征 质粒的自主复制性 质粒能利用寄主细胞的 DNA复制系统进行自主复制 根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大 复制类型 严紧型复制控制的质粒 松弛型复制控制的质粒 质粒 质粒的构建 理由： 天然存在的野生型质粒分子量大、拷贝数低、单 一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆 载体的要求 目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数野生型质 粒构建的 pSC101 四环素抗性标记基因 Tetr ColE1 大肠杆菌内毒素标记基因 E1 常用的质粒载
14、体 是通过 DNA重组技术构建而成的。 pUC18, pUC19 理想质粒载体应具备特点： 1. 松驰型复制子 复制子（ replicon） 是质粒自我增殖所必需 2. 几个单一的酶切位点（或多克隆位点） 以便目的 DNA片段插入 一、质粒载体 一、质粒载体 3. 插入失活的筛选标记 一般应具有 两种 抗菌素抗性标志 如氨苄青霉素抗性基因（ Ampr） 和四环素抗性 基因（ Tetr） 等 4.分子量相对较小和较高的拷贝数 5.缺点：容量较小，一般只能接受小于 15kb的 DNA 一、质粒载体 (plasmid vector) （一） pBR322质粒载体 （二） pUC质粒载体系列 （一）
15、pBR322质粒载体 pBR322载体是最早被广泛应用克隆的载体之一，至今尚 在使用。 pBR322载体的组成： 复制起始位点（ ori） Ampr Tetr 一、质粒载体 p代表质粒 ; “BR”代表两位研究者 Bolivar和 Rogigerus 姓氏的字首； “322”是实验编号 pBR322质粒载体和特点 1. 带有一个复制起始点（ ori） 2. 抗生素抗性基因（ Ampr和 Tetr） 作选择标记 3. 数个单一的限制性酶切位点 当外源基因插入这些抗性位点时，就分别成为 Amp 敏感（ Amps） 或 Tet敏感（ Tets）， 即 插入失活 一、质粒载体 4. 较小的分子量 易于
16、自身 DNA的纯化，而且能有效地克隆 6kb大 小的外源 DNA片段。 5. 较高的拷贝数 经氯霉素扩增后，每个细胞达 10003000个拷贝。 一、质粒载体 r r pBR332质粒结构示意图 （二） pUC质粒载体系列 n 在 pBR322基础上改建而成 一、质粒载体 典型的 pUC质粒载体有 4个组成部分： 来自 pBR322 质粒的复制起始点 Ampr基因 大肠杆菌 - 半乳糖苷酶基因 （ LacZ） 的启动子及其编码 - 肽链的 DNA序列，称为 LacZ 基因 位于 LacZ 基因中靠近 5- 端的一段 多克隆位点区段 ， 但并未破坏该基因的功能 pUC系列的优越性 最通用的大肠杆
17、菌克隆载体之一 优点 具有更小的分子量和更高的拷贝数 构建 pUC系列时仅保留了 pBR322的复制子和 Ampr 具有来自大肠杆菌 LacZ操纵子的 LacZ 基因， 适应于组织化学筛选重组体 一、质粒载体 r pUC18/pUC19质粒载体结构 病毒基本结构： DNA（或 RNA） + 外壳蛋白 感染细菌的病毒，称为 噬菌体 。 分类 （根据病毒与宿主的关系）： 温和性病毒： 溶原性增殖 构建病毒载体 烈性病毒： 溶菌性增殖 改造后 二、噬菌体和病毒载体 噬菌体或病毒 DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA l 噬菌体的生物学特性： 生物结构 l 噬菌体常指 大肠杆菌的温和型噬菌体 l 噬
18、菌体 由外壳包装蛋白和 l-DNA组成 l-DNA全长 48502个 bp COS区 : 噬菌体两端存在 的 12bp的互补序列 . 噬菌体或病毒 DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA l 噬菌体生物学特性： 感染周期 E.coli 吸 附 LamB受体 注 入 复 制 包 装 裂解 噬菌体或病毒 DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA l-DNA载体的构建： 缩短长度 缩短野生型 l-DNA的长度 ，可以提高装载 量。 根据切除的多少，可将 l-DNA分成两大 类载体： 插入型载体 取代型载体 大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA l-DNA载体的构建： 缩短长度 插入型载体 体外包装插入位点
19、体外包装插入片 段 载体长度 37 kb 插入片段大小： 0 - 14 kb （ 51 37） gt10（ 插入型）结构 噬菌体或病毒 DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体 DNAl-DNA载体的构建： 缩短长度 取代型载体 体外包装 体外包装插入片段 最小装载长度 10 kb （ 51 26） 载体长度 26 kb 插入片段 最大装载长度 25 kb （ 36 26） Charon 40（ 替换型）结构 75%105% 大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA l-DNA载体的构建： 删除重复的酶切位点 野生型的 l-DNA链上有 5个 EcoRI位点和 7个 HindIII位点， 不 利于重组操作，必须删
20、除至 1 - 2个 同时，为了便于各种来源的 DNA片段的克隆，还需要 增加一些单一的酶切位点 大肠杆菌的 l 噬菌体 DNA l-DNA载体的构建： 加装选择标记 与质粒不同，野生型 l-DNA上缺少合适的选择标 记，因此加装 选择标记是 l-DNA克隆载体构建的重要内容 l-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列 两类： 免疫功能类标 记颜色反应类标 记 噬菌体或病毒 DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体 DNAl-DNA载体的构建： 加装选择标记 imm434 imm434基因编码一种阻止 l-噬菌体 进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记 基因的 l-载体进入受体细胞后，建立溶 原状态，细菌生长缓
21、慢，形成浑浊斑； 当外源 DNA插入到标记基因中，基因 灭活， l-重组分子便进入溶菌循环，形成 透明斑 噬菌体或病毒 DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体 DNAl-DNA载体的构建： 加装选择标记 lacZ lacZ基因编码 b-半乳糖苷酶，能催化 无色的 X-gal生成蓝色化合物。当外源基 因插入到 lacZ基因中，基因灭活，不能 合成蓝色化合物；而空载体 l-DNA则产 生蓝色透明斑 噬菌体或病毒 DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体 DNAl-DNA作为载体的优点： l-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌 l-DNA载体的装载能力为 25 kb， 远远大于质粒的装载量 重组 l-
22、DNA分子 的筛选较为方便 重组 l-DNA分子的提取较为简便 l-DNA载体适合克隆和扩增外源 DNA片段，但不适合表达 外源基因 噬菌体或病毒 DNA 大肠杆菌的 M13单链噬菌体 DNAM13噬菌体的生物学特性： 生物结构 M13噬菌体的外型呈丝状 M13 噬菌体 由外壳包装蛋白和 正 链 DNA组成 M13 DNA全长 6407个核苷酸 M13 DNA上 至少有 10个基因 2700个外壳蛋白分子 M13 噬菌体 不裂解宿主细胞，但抑制其生长 噬菌体或病毒 DNA 大肠杆菌的 M13单链噬菌体 DNAM13 DNA载体的特点： 使克隆的 DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外 这在
23、DNA定向突变中非常有用 M13重组分子筛选简便 被 M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混 浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊 斑的混浊度亦越大 但 M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有 1.5 kb 噬菌体或病毒 DNA 与动植物受体细胞相适应的载体一般选择相应动植物的病 毒基因组 DNA。 动植物病毒种类繁多，每一种动植物都有多种特异性的病 毒。 按照基因组的结构，可将动植物病毒分成四大类： 单链 DNA病毒 双链 DNA病毒 单链 RNA病毒 双链 RNA病毒 RNA病毒在自我复制时大多存在相应的 DNA中间反应物， 这些中间体可作为载体进行常规的 DNA重组 。
24、病毒载体： 一、 Ca MV克隆载体 花椰菜花叶病毒组（ CaMV） 特点：唯一以双链 DNA做为遗传物质的植物 病毒，共 12种病毒。 在插入外源 DNA厚会失去病毒感染性，不能 直接感染植物。 二、烟草花叶病毒（ TMV）克隆载体 单链 RNA， 6395bp n 特点：复制量和外壳蛋白表达量高，寄主范围广，能在整株 植物上快速扩散 n 常用作植物表达克隆载体 三、 SV40克隆载体 哺乳动物基因克隆载体 （猿猴空泡病毒 40） （一） SV40基因组 双链闭环 DNA： 5243bp （二） SV40-DNA复制与增殖 猿猴细胞 受纳细胞 嚙齿动物（小鼠、仓鼠） 非受纳细胞 ；细胞癌变
25、人： 1 2%细胞产生病毒颗粒，不会插入染色体，相对安全 三、穿梭载体 （ shuttle vector） n 带有原核和真核细胞的复制起始点 n 常将真核生物的克隆载体构建成穿梭载体，使其先在大肠杆菌中扩 增，将目的基因与之构成合适的重组体后，再转入真核细胞 n 若加上适当的真核启动子等元件，则成为真核表达载体，能在真核 细胞中表达插入载体中的外源基因 三、穿梭载体 （ shuttle vector） 真核系统载体还必需具备适当的筛选标记 一种筛选标记是，使用遗传缺陷型细胞株与载体的基因产物互 补（如 TK基因产物）。 另一种普遍使用的是抗新霉素基因。因此，真核克隆载体的构 成一般由来自噬菌
26、体、质粒和病毒的 DNA元件构建而成。 三、穿梭载体（ shuttle vector） （二）逆转录病毒载体 （一） SV40（ 猿猴病毒）载体 （一） SV40（ 猿猴病毒）载体 真核表达载体中的调控元件大都来源于 SV40的调控顺序和复制 信号 用 SV40作为载体有两种方式 用 SV40 DNA与外源 DNA构建重组子，转染细胞后允许细胞形 成含外源 DNA的病毒颗粒； 重组子不包装成病毒颗粒，而象质粒一样在细胞中复制或 整合到染色体组中。 三、穿梭载体（ shuttle vector） 例： PSVK3质粒 n PSVK3是一类广泛适用于哺乳动物细胞系表达外源基因的穿梭载体。 三、穿梭
27、载体（ shuttle vector） PSVK3具有下列构件： 原核系统构件： 复制子和丝状噬菌体复制起始位点 fl; 筛选标志（ Ampr）； 启动子（ T7启动子）。 真核系统构件： SV40复制起始点； SV40早期启动子 RNA修饰信号： SV40小 T抗原拼接信号； SV40早期区 mRNA polyA加尾信号。 多克隆位点： SV40启动子下游有 8个酶切位点。 三、穿梭载体（ shuttle vector） pSVK3质粒 （二）逆转录病毒载体 逆转录病毒载体具有几个特点 具有广泛的哺乳动物细胞宿主 较大的容量，能插入 7kb大小甚至更大的外源基因 三、穿梭载体（ shuttl
28、e vector） 病毒基因组自身含有完整高效的调控元件 病毒可通过主动感染方式进入宿主细胞，并能有效地整合到宿 主染色体基因组中，与染色体一起复制、长期存在 逆转录病毒作为载体需要相应的外包装，以形成完整的体系 逆转录病毒载体的局限性： 逆转录病毒载体进入细胞依赖于细胞表面的受体，并且只能感染并 整合到分裂增殖期的细胞； 装载容量较小，仅 8kb左右，不适用于较大的基因； 安性问题，最大的危险是制剂过程中可能存在具有复制能力的野生 型病毒 三、穿梭载体（ shuttle vector） 常用外源 DNA片段取代病毒中的癌基因，即卸去其致癌性，称为卸甲载体（ disarmed vector）。
29、 四、人工染色体 (artificial chromosome) n 酵母人工染色体 （ YAC） n 细菌人工染色体 （ BAC） n 噬菌体 P1衍生的人工染色体 （ PAC） n 哺乳动物人工染色体 （ MAC） YAC主要调控元件 n 着丝粒 保证染色体细胞分裂过程中正确分配到 子代细胞 n 端粒 防止染色体被核酸外切酶降解的功能 n 复制起始点和限制性酶切位点 四、人工染色体 n 筛选标记 YAC载体的两臂均带有选择标记，在酵母中选择标记一 般为色氨酸、亮氨酸、组氨酸或尿嘧啶的合成基因产物插入失活 而进行筛选 n 原核序列及调控元件 包括大肠杆菌复制起始点、 Ampr基因等，以 便于
30、在大肠杆菌中操作 YAC作为载体的主要特点 n 酵母是单细胞真核生物，培养方便； n 酵母的真核细胞转录系统，有利于表达真核生物基因； n 装载容量巨大，可达 Mbp水平； 四、人工染色体 n YAC的克隆程序相似于基因组 DNA的常规克隆； DNA在片段连接 到 YAC载体的（两）臂上形成重组体，随后该重组体可通过常 规方法导入酵母； n 已广泛应用于各种生物基因组计划。 质粒 质粒 DNA的分离纯化 实验室 一般使用下列三种方法制备质粒 DNA ： 氯化铯密度梯度离心法 质粒 DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染 碱溶法 质粒 DNA纯度底、快速、操作简便 沸水浴法 质粒 DNA纯
31、度、操作周期介于 氯化铯法和碱溶法之间 质粒 质粒 DNA的分离纯化 氯化铯密度梯度离心法： 用含有 EDTA的缓冲液悬浮菌体 加溶菌酶裂解细菌细胞壁 加 CsCl和 溴乙锭 超速离心过夜 在紫外灯下吸取 cccDNA 稀释沉淀 cccDNA proteins ocDNA L-DNA cccDNA RNAs 质粒 质粒 DNA的分离纯化 碱溶法： 用含有 EDTA的缓冲液悬浮菌体 加溶菌酶裂解细菌细胞壁 加 NaOH和 SDS的混合溶液，去膜释放内含物 加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染 色体 DNA及大部分蛋白质 离心取上清液，用苯酚 -氯仿萃取，去除痕量的蛋白质 乙醇或异丙醇沉淀水相
32、质粒 DNA 用无 DNase的 RNase去除残余的 RNA cccDNA L-DNAocDNA D-DNAT-DNA 质粒 质粒 DNA的分离纯化 沸水浴法： 用含有 EDTA和 Triton X-100的缓冲液悬浮菌体 加溶菌酶裂解细菌细胞壁 沸水浴 40秒钟 离心，用无菌牙签挑去沉淀物 乙醇或异丙醇沉淀质粒 DNA 考斯质粒与噬菌粒 l-DNA载体和 M13-DNA载体的装载量最大分别为 25 kb和 1.5 kb， 但在很多情况下，往往需要 克隆更大的外源 DNA片段， 考斯质粒和噬菌粒载体的构建就是为了进一步提高噬菌体 DNA 的装载量。 在包装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌体
33、DNA的长度， 就能同步增加载体的装载能力。将噬菌体 DNA与包装有关的序 列与质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，同时 又能保证重组 DNA分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒，这 便是构建考斯质粒和噬菌粒载体的思路。当然，由于考斯质粒 和噬菌粒不再携带包装蛋白基因，因此重组 DNA分子在细胞内 不能形成噬菌体颗粒。 考斯质粒与噬菌粒 考斯质粒（ cosmid ） 考斯质粒载体的构建： 考斯质粒是一类人工构建的含有 1978年 Collins和 Hohn发明构建 pHC79 6400 bp Tcr l fragmentcos ori Apr PstI BamHI SalI l-DNA
34、 cos序列和 质粒复制子的 特殊类型的载体 cos site - carrying plasmid 1.8 kb的 l-DNA片段 + pBR322片段 装载范围为 31 - 45 kb 考斯质粒与噬菌粒 考斯质粒（ cosmid ） 考斯质粒载体的特点： 能像 l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞 装载量大（ 45 kb） 且克隆片段具有一定的大小范围 能像质粒那样在受体细胞 中自主复制 重组操作简便，筛选容易 不能体内包装，不裂解 受体细胞 考斯质粒与噬菌粒 噬菌粒（ phagemid or phasmid） 噬菌粒载体的特点： 噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体 包装序列、
35、复制子 以及 质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体 能像 M13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞 装载量比常规的 M13mp系列要大很多（ 10 kb） 能像质粒那样在受体细胞 中自主复制 重组操作简便，筛选容易 通过克隆双链 DNA能获得同等长度的单一单链 DNA 考斯质粒与噬菌粒 噬菌粒（ phagemid or phasmid） 重要的噬菌粒载体： pUC118 / 119 pUC118 pUC18 + M13间隔区 IG pUC119 pUC19 + M13间隔区 IG 500 个拷贝 3200 bp MCS lacZ lacI ori Apr M13-MG pUC1
36、18 / 119 表示 M13辅助噬菌体 DNA 考斯质粒与噬菌粒 噬菌粒（ phagemid or phasmid） 重要的噬菌粒载体： pBluescript 体外转录载体 pBluescript = pUC + f1-ori + PT3 + PT7 2958 bp MCS lacZ PT7 ori Apr f1-ori pBluescript PT3 噬菌体启动子 PT3和 PT7强化外 源基因的转录 提取出来的单链 DNA重组分 子 在噬菌体 RNA聚合酶的存 在下，又可实现外源基因 的体外转录 人造染色体载体 人类、动物、植物的全基因组序列分析往往 需要 克隆数百 甚至上千 kb 的
37、 DNA片段， 此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载 量也远远不能满足需要。 将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳 定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外 源 DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体， 它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。 目前常用的人造染色体载体包括： 细菌人造染色体（ BAC） 酵母人造染色体（ YAC） 人造染色体载体 细菌人造染色体（ Bacterial Artificial Chromosomes BAC） 细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子 F质粒的基础上 构建的，其装载量范围在 50 - 300 kb之间 各
38、种类型的 pBACs在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝 pBACs主要适用于： 克隆大型基因簇（ gene cluster） 结构 构建动植物基因文库 人造染色体载体 酵母人造染色体（ Yeast Artificial Chromosomes YAC ） YAC载体应含有下列元件： 酵母染色体的端粒序列 酵母人造染色体的构建： pYAC4 CEN4 EcoRI URA3 TELBamHITEL ori Apr TRP1 ARS1 酵母染色体的复制子 酵母染色体的中心粒序列 酵母系统的 选择标记 大肠杆菌的复制子 大肠杆菌的 选择标记 YAC载体的装载量为 350 - 400 kb 人造染色体载体
39、 酵母人造染色体（ Yeast Artificial Chromosomes YAC ） 酵母人造染色体的使用： pYAC4 CEN EcoRI URA TELBamHITEL ori Apr TRP ARS EcoRIEcoRIEcoRI BamHI 连接 转化酵母菌重组酵母染色体 C 用于基因转移的受体菌或细胞 3 基因工程的基本条件 各种基因工程受体的 特性实验室常用的基因工程 受体 受体细胞应具备的 条件 受体细胞应具备的条件 限制性缺陷型 外切酶和内切酶活性缺陷（ recB-， recC-， hsdR-） 重组整合缺陷 型 用于基因扩增或高效表达的受体细胞 （ recA -） 具有较
40、高的转化效 率具有与载体选择标记互补的 表型感染寄生缺陷 型 防止重组细菌扩散污染，生物武器除外 各种基因工程受体的特性 大肠杆 菌 遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简 单，重组子稳定 适用于外源 DNA的扩增和克隆、原核生物基因的高效 表达、基因文库的构建，是 DNA重组实验和基因工程的主 要受体菌 产结构复杂、种类繁多的内毒素 各种基因工程受体的特性 枯草杆 菌 遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全 ，生长迅速，培 养简单，不产内毒素 适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽的 有效分泌 遗传欠稳定，载体受体系统欠完备 各种基因工程受体的特性 链霉菌 抗生素的主要生产者，分
41、子遗传相对操作简便，不产内毒素 主要用于抗生素生产菌株的改良 遗传不稳定，生长相对缓慢 各种基因工程受体的特性 酵母菌 具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养 简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定 适用于外源 DNA的扩增、克隆以及真核生物基因的高 效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究， 是 DNA重组实验和基因工程重要的真核性受体菌 内源性蛋白产物种类繁多且含量高 各种基因工程受体的特性 昆虫细胞（家蚕 ） 具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁殖相对较 快，培养成本低廉，遗传稳定 适用于真核生物基因的高效表达 DNA重组操作系统欠完善 各种基因工程受体的特性 哺乳
42、动物细胞（中国 仓鼠卵巢细胞 CHO） 与人的亲缘关系近，分子重组表达系统健全，具有合适 的糖基化修饰系统 适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物 的生产，是 DNA重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体 细胞培养条件苛刻，生长缓慢 各种基因工程受体的特性 植物细胞（拟南芥菜、烟叶 ） 农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于分化，细 胞培养简单且成本低廉，具有光合作用 适用于高等植物基因表达调控的研究、基因药物的生产， 农作物品质的改良 遗传操作繁琐 实验室常用的基因工程受体 大肠杆菌 用于接受质粒： C600、 W3110、 HB101、 JM83、 JM101（ Aps、 Tcs、 Cms） 用于接受 l-DNA： LE392、 ED8654 酵母菌 哺乳动物细胞 CHO 毕赤酵母 啤酒酵母 载体的功能及特征 载体的功能 运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件
