1、GENE MANIPUTATION AND ITS APPLICATION IN MEDICAL PRACTICE 基因操作及其医学应用 鲍 朗 教 授 基因操作的概念 基因操作的 基本 策 略 定义： 在基因水平上进行人工操作并改变其生物遗 传性的技术称基因操作。所采用的主要手段为 DNA重 组技术，主要程序是将 DNA片段插入到质粒、病毒等 载体中，形成遗传 物质的新组合，然后 转移到宿主细胞产生 新的表型。 What is the Gene? 基因（基因（ gene） 是核酸链上贮存遗传信息的遗传单位，是贮 存有功能的蛋白质多肽信息及表达这些信息所 必需的全部核苷酸序列。 What is
2、 the Genome? 基因组（基因组（ genome） o 指细胞或生物中，一套完整单倍体遗传物指细胞或生物中，一套完整单倍体遗传物 质的总和，包括全套基因及间隔序列。质的总和，包括全套基因及间隔序列。 o 人类基因组包含 22条常染色体和 XY两条性 染色体（核基因组）以及线粒体上的遗传 物质（线粒体基因组） 。 原核基因组和 真核基因组 o 真核生物基因组远远大于原核生物的基因组，结 构复杂，基因数庞大，具有许多复制起始点，每 个复制子大小不一 o 人类染色体单倍体 DNA全长 310 9bp，含 34万个 基因。 o 大肠杆菌 DNA全长 4.6106bp，含 4000个基因。 原核
3、基因组 Prokaryote Genome 基因组通常仅由 一条环状双链一条环状双链 DNA分子组成。分子组成。 基因组中 只有只有 1个复制起点个复制起点 。 基因组中的重复序列很少，编码蛋白质结构基因多为 单拷贝。 基本结构特点：基本结构特点： 启动子（ promoter）、操纵基因（ operator）、调控序列、结构基因（ structure gene ）、终止子（ terminator）。 基因序列是连续的，无内含子结构基因序列是连续的，无内含子结构 连续密码区 mRNA Protein 基本结构： 结构基因（结构基因（ structural gene） 指能转录成为 mRNA、 r
4、RNA或 tRNA的 DNA顺序。 结构基因不连续，编码序列被非编码序列打断， 分割成 几段， 编码序列称为外显子 (exon)， 其间的序列称为内 含子 (intron),称为 断裂基因（断裂基因（ split gene）。）。 非编码区 剪切 编码区 编码区 mRNA Protein 真核基因组 Eukaryote Genome intron exonexon 有大量重复序列 获取目的基因常常是基因操作的首要获取目的基因常常是基因操作的首要 步骤。步骤。 化学合成法化学合成法 基因文库法（或基因文库法（或 cDNA文库法）文库法） PCR法法 获取目的基因获取目的基因 较短的基因（较短的基
5、因（ 60-80bp） 用途：用途： PCR引物引物 测序引物测序引物 定点突变定点突变 核酸杂交探针核酸杂交探针 化化 学学 合合 成成 法法 构建不同的基因文库构建不同的基因文库 通过核酸杂交的筛选通过核酸杂交的筛选 或通过抗原抗体反应的筛选或通过抗原抗体反应的筛选 基基 因因 文文 库库 法法 获取目的基因 聚合酶链反应（ polymerase chain reaction, PCR）是在体 外进行的由引物介导的 酶促 DNA扩增反应。是获 取已知序列候选基因的 主要方法。 PCR法法 PCR技术的基本过程技术的基本过程 模板模板 DNA dNTP 引物引物 Buffer 预变性预变性
6、模板模板 DNA dNTP 引物引物 Buffer TaqDNA聚合酶聚合酶 循循 环环 仪仪94oC5 94 55 72 基因重组 o 基因操作的关键步骤和核心内容 o 关系到研究的成败或质量 o 包括：基因分离，基因组合，基因转化，基因筛选 分分 : 切切 : 限制性内切酶限制性内切酶 “ 分子手术刀分子手术刀 ” 限制性核酸内切酶命名 Smith和 Nathame命名原则（ 1973） 属名 + 种名 + 株名 + 流水号 举例： 流感噬血杆菌 d株 （ Haemophilus influengae d） Hind Hind Hind 5 AAGCTT 3 Hind 3 TTCGAA 5
7、 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 restriction endonuclease 在特异位点上切割在特异位点上切割 DNA分子分子 分三类，常用为分三类，常用为 类酶类酶 识别序列呈回文对称识别序列呈回文对称 （ palindrome sequence） 5 GAATTC 3 5 GGATCC 3 3 CTTAAG 5 3 CCTAGG 5 EcoR 的识别序列的识别序列 5- GAATTC-3 3- CTTAAG -5 Hae 的识别序列的识别序列 5- GTTAAC-3 3- CAATTG -5 限制性核酸内切酶酶切 单酶切 用一种限制酶 酶切目的基因 和载体 易发生自身连 接 双酶切
8、 用二种限制酶 酶切目的基因 和载体 不易发生自身 连接 接接 : “ 分子针线分子针线 ” 目的基因片段与载体的连接 粘末端法：碱性磷酸酶退火 平接法： T4噬菌体 DNA连接 接头法：人工合成 R.E识别顺序 聚尾法：分别加连 polyA(T)或 G 是独立于许多细菌及某些真核细胞染色体外共 价闭合环状的 双链双链 DNA分子， 大小在大小在 1200kb 之间之间 ， 能独立复制的最小遗传单位。 质粒质粒 （ plasmid） 质粒的分类 克隆载体 (cloning vector,Puc18,19)都有松弛的复 制子，能带动外源基因在宿主细胞中复制扩增 。带有一些基本元件（ ori,Am
9、pr,Mcs等），用来 克隆和扩增基因片段。 表达载体 (Expression vector,PET30a,pMV361)除 了有克隆载体的基本元件，还具有转录 /翻译所 必需的 DNA顺序。为了有效的转录，必需有强 大的启动子 (Trp,Lac)。 重组 DNA的转化与增殖 制备 Competence Cell（氯化钙处理幼嫩 E.coli,yeast,动物 cell,昆虫 .) C Cell-R.DNA ”Hot shock”(42 ， 2) L B Culture37 ， lhr LB agar plate genomic library 转转 : 1. 阳性重组体的筛选 抗药基因 抗
10、Ampicilin基因 Ampicilin敏感受体细胞 Ampicilin 培养基 未转化菌落不能存活 筛筛 : 2.颜色反应 Lac+Polylinker+- 半乳糖苷酶 Xgal 蓝色 /白色 利用 3 影印原位杂交（ Situ Hybridization) 菌落 硝酸纤维滤膜 阳性重组体 原位固定 重组探针杂交 4. 斑点杂交 ( Dot Blots ) 已知重组 DNA 滤膜 重组 DNA同源性和特异性 方阵打点 阳性重组 DNA探针杂交 基因操作的 基本 策 略 5. southern杂交 DNA片段吸印 重组探针杂交 后处理 外源基因表达 o 克隆基因在原核细胞中表达 o 克隆基因
11、在哺乳动物细胞中表达 o 克隆基因在其它表达系统中表达 昆虫表达系统 酵母表达系统 在原核表达体系（以 Ecoli为代表） ： 优点 1.遗传背景清楚 ,易于调控 ; 2.表达技术经典成熟 ,应用广泛 ,目前无以取代 ; 3.目的基因表达水平高 , E.coli培养周期短， “ 物美价廉 ”. 缺点 1. 缺少真核蛋白质翻译后加工修饰系统 ,如剪切 ,糖基化 ,及正确二硫 键形成等 ; 2. 表达蛋白质多以包涵体形式存在 ,需经复性才能恢复构象与活性； 3. 宿主本身杂蛋白质多 ,纯化步骤复杂 ,故某些蛋白质 ,特别时糖蛋白 或脂蛋白 , 酌情选择真核表达载体。 真核表达体系（酵母、昆虫、哺乳
12、动物细胞） 优点： 能转录后加工，即能剪接内含子；能翻 译后加工，即能糖基化修饰等；通常不形成包 涵体，能正确折叠。 缺点： 但技术难度较大，成本较高，表达量较 低。 转基因和基因治疗 转基因和基因治疗 1概念和研究现状 2基因治疗的基本类型 3转基因的基本方法 4. 转基因的表达和调控 5基因治疗的运用和前景 内 容 提 纲 基因治疗是以正常基因替代或置换 靶细胞 染色质基因组中的 致病基因从而产生新表型 的治疗方法。 转基因技术则是 将目的基因导入靶细胞以 建立治疗效应的 方法 和 过程。 转基因及 基因治疗 基 本 概 念 转基因及 基因治疗 基因治疗的程序 目的基因 转基因 基因表达
13、基因治疗 viral nonviral In vivo ex vivo 体内调控 基因治疗的基本类型 细胞介导的基因治疗 (ex Vivo) 是当前较常用的形式。是选用适当的靶细胞载体外进 行基因转移，筛选阳性细胞重新移植入体内。可用原 代或细胞系进行。但靶细胞存活较短暂（ Transit)。 体外表达基因治疗 (in Vitro) 是传统的基因表达形式。 1、 病毒法 (Viral) 1)逆转录病毒 (Restrovirus) RNA病毒，结构缺陷 Packaging Cell 转基因及 基因治疗 转基因的基本方法 体内直接转基因治疗（ in Vivo） 转基因及 基因治疗 基因治疗的基本类
14、型 是最有前途的方式。已在肝、气管、肌肉 、乳腺、腹腔动、静脉初获成功。效果持 久。但转移和表达效率低。 优势： 整合率高 ; 对外源 DNA影响小 ; 单拷贝整合，利于表达调控； 安全。 转基因及 基因治疗 转基因的基本方法 劣势： 容量小 ; 只能感染分裂活跃细胞，体外 (Exvivo)转基因 ; Transite expression; R.V.+P.C+P.C 实验室要求高。 转基因及 基因治疗 转基因的基本方法 2） 腺病毒 (Adenovirus) 腺相关病毒 (Adenoassociated virus) DNA病毒 E1和 E3基因缺乏 263细胞系生长 转基因及 基因治疗 转
15、基因的基本方法 特点： 能感染静止细胞，体内 (in vivo)转基因 对某些细胞类型特别亲和力， 利于局部基因治疗 包容量大 尚无 Packaging Cell，欠安全 有较强免疫原性，易引起体内 免疫反应 转基因及 基因治疗 转基因的基本方法 2、非病毒法 (Nonviral) 1） 显微注射法 (Microinjection) 2) 基因定位整合技术 (Gene targeting) 3) 受体介导 (Receptor-mediated methods) 4) 组织内直接注射 (Direct injection of DNA) 5) 磷酸钙沉淀法 (CaPO4 precipitation
16、) 转基因及 基因治疗 转基因的基本方法 1、 肿瘤的基因治疗 1) 肿瘤的免疫基因治疗 载体细胞靶向表达细胞因子 载体细胞 : 肿瘤浸润淋巴细胞 (TILs) 淋巴因子激活的杀伤细胞 (LAKs) 细胞因子 :IL-1,2,4,6,7, IFNs， TNF-,CSF 。 肿瘤疫苗 : 改变肿瘤细胞免疫原性，诱导强 烈免疫反应 转基因及 基因治疗 基因治疗的应用 2)反义技术抑制肿瘤基因功能 人工合成癌基因 DNA或 RNA(mRNA)互补寡核苷酸， “ 封闭 ” 癌基因的转录或翻译。 转基因及 基因治疗 基因治疗的应用 3)病毒导向酶解药物前体疗法 (VDEPT) -“ 自杀基因 ”(Sui
17、cide gene) 该基因编码的酶能活化无毒药物前体杀伤该酶所 在的细胞。将 “ 自杀基因 ” 转染肿瘤细胞，使用对正 常细胞无毒药物前体，选择杀伤肿瘤细胞。 转基因及 基因治疗 基因治疗的应用 转基因及 基因治疗 基因治疗的应用 (肝癌细胞） 单纯疱疹胸苷激酶 (HSV-Tk) 甲氧嘌呤阿拉伯糖苷 AM(D.T) 阿拉伯糖苷酸 杀伤肝癌细胞（无毒前体 ） 活化 2 传染病基因治疗 1） 刺激更强的机体抗 HIV免疫反应 转基因及 基因治疗 基因治疗的应用 (HIV患者 )成纤维细胞 HIV pM160 g p 160 诱导细胞毒 T淋巴细胞杀伤 HIV感染细胞 R.V. 表达 2） 干扰病
18、毒复制 转基因及 基因治疗 基因治疗的应用 核酸 (Ribozyme): Ribozyme gene HIV患者 CD4 破环基因完整性 反义药物 GEM-91: 25bps反义寡核苷酸 HIV gag蛋白 mRNA 抑制 HIV复制 封闭 转基因及 基因治疗 3） 其它传染病基因治疗： HBV 流感病毒 单纯疱疹病毒 流行性出血热 水泡性口炎病毒 基因治疗的应用 3 遗传病的基因治疗 腺苷酸脱氨酶缺乏症 (ADA) (欧盟、美国 ) 囊纤维变性 (CF) (美国、英国 ) 人家族性高胆固醇血症 (FH) (美国 ) 血友病 B-IX因子成纤维细胞表达 (中国 ) 地中海贫血 (中国 ) 转基因及 基因治疗 基因治疗的应用 转基因及 基因治疗 基因治疗的应用 4神经系统疾病的基因治疗 * 这些遗传病能造成神经系统损伤 转基因及 基因治疗 基因治疗的应用 5心血管系统疾病的基因治疗 6其它： 色素性视网膜炎、红斑狼疮，血液疾病， 慢性肝病等。 转基因及 基因治疗 基因治疗的应用 转基因及 基因治疗 基因治疗的应用 基因治疗的体内调控 无需精确调控的病种：遗传性疾病、肿瘤、 感染性疾病等 需精确调控的病种： 2型糖尿病等
