1、蛋白酶活力的测定 目的与原理 掌握蛋白酶活力的测定方法，测定鱼、虾、贝等水产动物主要消化器官肝胰脏、胃、肠等 蛋白酶的活力。 动物消化器官内含有各种消化腺，这些消化腺分泌消化酶进行化学性消化作用，将机体摄 入的大分子营养物质转变为可溶性小分子物质而吸收进入血液循环。本实验采用福林酚 法测定机体内主要消化酶蛋白酶活力。福林酚试剂（Folinphenol）在碱性溶液中极 不稳定，易被酚类化合物还原为蓝色化合物。蛋白质中含有酚基的氨基酸包括（酪氨酸、 色氨酸、苯丙氨酸），用蛋白酶分解酪蛋白（底物），生成含酚基的氨基酸与福林酚试 剂成蓝色反应，可从蓝色的深浅测知酶活力多少。 试剂与器材 试剂： 1、福
2、林试剂：在 2000ml 磨口回流装置内加入钨酸钠（Na 2WO42 H2O）100g，钼酸 钠(Na 2MoO42H2O)25g，水 700ml，35磷酸 50ml，浓盐酸 100ml，文火回流 10 小时，然后加人硫酸锂 50g，水 50ml 和溴水数滴，摇匀，去除冷凝器，继续煮沸 15 分 钟，以除去多余的溴。溶液呈金黄色，冷却后，定容至 1000ml，过滤，滤液即福林试剂 （试剂不应呈绿色，否则需重配）。置于棕色瓶中保存，使用时用氢氧化钠标定，稀释至 1N。 2、0.55M 碳酸钠溶液 3、10三氯乙酸 4、0.02M pH7.5 磷酸缓冲液： 0.02M 磷酸氢二钠溶液的配制：取 N
3、a2HPO42H2O 3.561g (或 Na2HPO412H2O 7.164g)，溶解于 1L 蒸馏水中。0.02M 磷酸二氢钠溶液的配制：取 NaH2PO4 H2O 2.76g (或 NaH2PO4 2H2O 3.121g)，溶解于 1L 蒸馏水中。 将 0.02M 磷酸氢二钠溶液 84ml 与 0.02M 磷酸二氢钠溶液 16ml 混合，即为 0.02M pH7.5 磷酸缓冲液。 5、0.5酪素：（酪蛋白）0.5 克，以 0.5N NaOH 1ml 湿润。再加少量 0.02MpH7.5 磷酸缓冲液稀释。在热水浴中溶解，定容至 100ml，冰箱中可保存一周。 材料： 鲜活鱼、虾、贝的肝胰脏
4、、胃、肠标本。 器材： 分光光度计、光径 1.0cm 比色杯、离心管、电子天平、离心机、匀浆器、剪子、镊子、 冰块、试管若干、移液管若干。 实验步骤 1、酶粗提液的制备 取新鲜肝胰脏、胃、肠组织称重，在冰盘上剔除脂肪及内容物，以 10 倍缓冲液或去离子 水匀浆各组织，将组织悬液低温下离心（3000rpm/min）,上清液为酶粗提液（酶液）。 2、酶活力测定 （1）标准曲线的制作：精确称取烘干的酪氨酸 50mg，加少量 0.2N 盐酸溶解，定容至 100ml，分别配制溶液 0100g/ml不同浓度溶液，不同浓度各取酪氨酸溶液 1ml，加 0.5酪素 2ml，于 370C 水浴中反应 15 分钟，
5、然后加入三氯乙酸 3ml，离心除去沉淀。 取清液 1ml，加入 0.55M 碳酸钠 5ml，再加入福林试剂 1ml，于 370C 水浴显色 15 分 钟，在 680nm 波长下比色，测光密度（O D）。以光密度读数为纵坐标，酪氨酸的微克 数为横坐标，绘制曲线。 （2）样品测定 样品测定设对照管和测定管。 对照管 测定管 适当稀释酶溶液 / 1ml 去离子水 1ml / 370C 水浴预热 3-5 分钟 0.5 酪素（预热过） 2ml 2ml 370C 水浴准确反应 15 分钟 10三氯乙酸 3ml 3ml 离心去除沉淀 取上清液于另外试管内 1ml 1ml 0.55M 碳酸钠 5ml 5ml
6、福林试剂 1ml 1ml 37水浴显色 15 分钟，680nm 波长比色，以对照管校零，读取测定管光密度。 3、计算 在 37 下每分钟水解酪素产生 1g酪氨酸为一个酶活力单位 蛋白酶的活力单位A/15F A 为样品测得光密度查曲线，得相应酪氨酸 g数 F 为酶液最终稀释倍数，15 为反应时间（min） 方法评估 福林酚法测定蛋白酶活力是生产实践和科学研究中应用的基本实验方法。 应用意义 水产动物消化系统内的消化酶随动物种类而异，而且消化酶的种类和在消化道中分布的差 别是和动物食性相适应的。分析消化蛋白酶活力有助于了解动物对蛋白质食物的消化能力， 掌握动物的营养需求。 注意事项 1、实验材料应
7、新鲜，不新鲜会发生组织自溶和酶原被破坏。 2、酶液与底物作用时间、作用温度要严格控制，否则数据误差很大。 3、酶液要用适当缓冲液稀释到测定光密度在 0.20.6 之间。 淀粉酶活力的测定 目的与原理 掌握淀粉酶活力的测定方法，测定水产经济动物的主要消化器官肝胰脏、胃、肠内的淀粉 酶活力。 淀粉酶催化淀粉分子中葡萄糖苷键水解，产生葡萄糖、麦芽糖等。在基质充分的条件下， 反应后加入的碘液与未被水解的淀粉结合成蓝色复合物，其蓝色深浅与未经酶促反应的空 白管比较其吸光度，从而推算出淀粉酶的活力单位。 试剂与器材 试剂： 1、0.04%可溶性淀粉 精确称取可溶性淀粉 0.20g，置于 20ml 烧杯内，
8、加入蒸馏水约 5ml，摇匀使成淀粉混悬 液，另称取无水磷酸二氢钠 13.3g 及苯甲酸 4.3g，共置于 500ml 烧杯内，加入蒸馏水 约 250ml,煮沸后，将淀粉混悬液倒入此烧杯内，并用蒸馏水洗涤装淀粉混悬液的烧杯数 次，洗涤亦倒入此烧杯内。继续煮沸 1 分钟，冷却至室温后倒入 500ml 容量瓶中，并用 蒸馏水稀释至 500ml 刻度。此淀粉液 pH 应为 7.00.1，在室温下保存 23 个月。 2、0.1N 碘贮存液：精确称取碘酸钾(KIO 3) 3.567g 及碘化钾（KI）45g 置于 1L 容量 瓶内，加入蒸馏水约 800ml，然后缓慢加入浓盐酸 9ml，摇匀后用蒸馏水稀释至
9、 1L 刻度， 置冰箱内备用。 3、0.01N 碘应用液：取 0.1N 碘贮存液 50ml，用蒸馏水稀释至 500ml，盛于棕色瓶中 置冰箱内约保存 1 个月。 材料： 新鲜鱼、虾、贝的肝胰脏、胃、肠标本。 器材： 分光光度计、电子天平、离心机、pH 测定仪，恒温水箱、匀浆器、剪子、镊子、冰块、 50ml 比色管若干、移液管若干，500ml 容量瓶，烧杯。 实验步骤 1、酶提取液的制备（见实验蛋白酶活力的测定） 2、淀粉酶活力的测定 取 50ml 刻度比色管二只，标明为对照管，测定管。 对照管 测定管 0.04可溶性淀粉 5.0ml 5.0ml 将两管在 37水浴中预热 25 分钟 酶液 0.
10、1ml 测定管混匀后，再置 37水浴中反应 7.5 分钟 0.01N 碘应用液 5.0ml 5.0ml 用蒸馏水稀释至 50ml，立即混匀。用 660nm 或红色滤光板进行比色，以蒸馏水校正光 密度 0 点，读取对照管和测定管光密度读数。 3、计算 淀粉酶活力单位定义：在 370C、30min 内，100ml 酶液中的淀粉酶能完全水解淀粉 10mg 称为一个淀粉酶活力单位。 淀粉酶活力单位/100ml（对照管光密度测定管光密度）/对照管光密度 2/1030/7.5100/0.1=（对照管光密度测定管光密度）/对照管光密度800 方法评估 测定淀粉酶的方法有很多种，大致可分为两类：即测定底物（淀
11、粉）的减少量和测定产物 （如还原性糖）的生成量。本实验采用前者的淀粉碘比色法。 应用意义 分析淀粉酶的活力有助于了解水产动物对食物中淀粉的消化能力，由于鱼虾等水产动物种 类与大小的差异和所提供食物品质的不同，以及动物所处生活环境的变化，各种水产动物 对食物的消化吸收有明显的差别。认识鱼虾消化酶变化特性，为研究水产种类饲料配伍提 供科学依据 注意事项 1、0.04%可溶性淀粉溶液 5ml 内含淀粉量为 2mg，在本法条件下，当 2mg 淀粉完全 水解时相当于 800 淀粉酶单位100ml（即：2/10 30/7.5 100/0.1 = 800）。 2、对照管内含淀粉 2mg，由于淀粉溶液比较稳定
12、，故对照管在固定比色计上的光密度读 数并不改变，因而在测定中不必每次作对照管。 3、当淀粉酶接近 800 单位时，由于淀粉已几乎完全被水解，故加入碘液后也不再显蓝色， 因此淀粉酶单位较高时（接近 600 单位）宜将标本稀释（25 倍）后重新测定，并将测 定结果乘以稀释倍数。 4、如淀粉溶液出现混浊或絮状物，表示淀粉溶液污染或变质，不能再用。 5、唾液内含有大量的淀粉酶，故即使是唾液的飞沫污染，也能使测定结果显著偏高。 脂肪酶活力的测定 目的与原理 掌握脂肪酶活力的测定方法，并测定鱼、虾、贝体内消化器官肝胰脏、胃、肠的脂肪酶活 力。 脂肪酶在一定条件下，将甘油三酯水解。在不同水解阶段可分别产生脂
13、肪酸、甘油二酯、 甘油一酯及甘油。水解所产生的脂肪酸可以用标准的氢氧化钠滴定，用滴定值表示酶活力。 试剂与器材 试剂： 1、聚乙烯醇(P. V. P.)橄榄油乳化液：称取 40 克聚乙烯醇，加蒸馏水约 1000 毫升，在 小火上加热，并不停搅拌，至聚乙烯醇全部溶解，冷却后定容至 1000 毫升。用双层纱布 过滤，滤液备用。取 4聚乙烯醇溶液 150 毫升，加 50 毫升橄榄油，用高速组织捣碎机 搅动 6 分钟，即成乳白色聚乙烯醇橄榄油乳化液，保存于低温下（4 ）备用。 2、0.025M 磷酸缓冲液（pH7.5）。0.025M 磷酸氢二钠溶液的配置：取 Na2HPO42H2O 4.45g 溶于
14、1L 蒸馏水中，0.025M 磷酸二氢钠溶液的配置：取 NaH2PO4H2O 3.45g（或 NaH2PO42H2O 3.90g）溶于 1L 蒸馏水中。将 0.025M 磷 酸氢二钠 84ml 与 0.025M 磷酸二氢钠 16ml 混合，即为 0.025M 磷酸缓冲液。 3、0.05N 氢氧化钠标准溶液 4、1 酚酞指示剂：取 1g 酚酞溶于 100ml 70乙醇溶剂中。 5、95乙醇 材料： 鱼、虾、贝的肝胰脏、胃、肠标本。 器材： 匀浆器、离心机、恒温水浴。高速组织捣碎机、酸式滴定管、滴定管架、镊子、剪子、锥 形瓶、移液管、烧杯。 实验步骤 1、酶粗提液的制备（见蛋白酶活力的测定）。 2
15、、取 100ml 锥形瓶 3 个，一个作为对照组，另两个为测定组 对照组 测定组 1 测定组 2 0.025M 磷酸缓冲液（ pH7.5） 5ml 5ml 5ml 聚乙醇橄榄油乳化液 4ml 4ml 4ml 95乙醇 15ml 40水浴预热 510 分钟 酶液 1ml 1ml 1ml 40水浴保温 15 分钟（精确计时） 95乙醇 15ml 15ml 酚酞指示剂 3 滴 3 滴 3 滴 用 0.05N 标准氢氧化钠滴定至微红色，记录滴定用去 ml 数。 计算： 酶活力以国际单位表示，即在一定条件下，脂肪酶水解脂肪每分钟产生 1 微克分子脂肪酸 的酶量定为一个国际单位。 脂肪酶活力单位（AB）N
16、f t 式中： A 为样品耗碱液 ml 数， B 为对照组耗碱液 ml 数 N 为每毫升碱液微克分子数，f 为稀释倍数 t 为作用时间 (分) 方法评估 测定脂肪酶活力的方法大致可分为 3 类：即测定产物（游离脂肪酸）的增加量（如滴定法、 比色法、分光光度法、荧光法和 pH 电极法等）；测定底物的减少量（如比浊法、扩散法 等）；测定脂酶的实际量（如放射免疫法和乳胶凝集法等）。本实验用滴定法测定脂肪酶 活力，此法灵敏度较差，样品用量大，但所需设备较简单，可随时进行检测。 应用意义 脂肪酶是动物消化脂肪的重要酶类其分泌量和活力与动物对脂肪的消化、吸收、利用有关。 水产动物肝胰脏或胰脏是脂肪酶的主要分泌器官，胃肠粘膜及肝脏亦能分泌，有的鱼类幽 门垂中脂肪酶活力最高。测定水产动物各部位脂肪酶活力有助于研究、分析其对脂肪的消 化能力及各部位消化功能状况。 注意事项 1、使用聚乙烯醇的聚合度为 10001750 ，如聚合度低，乳化效果差。橄榄油乳化液在 冰箱中保存三天左右仍能保持稳定。 2、反应终了加乙醇可停止酶作用和溶解脂肪酸，以利滴定，乙醇用量以不低于总容量 60%为 宜。
