单核增生李斯特氏菌检测.ppt

1、单击此处编辑母版标题 样式 单击此处编辑母版副标题样式 * 1 单核增生李斯特氏菌 检测概述 内 容 o 简介李斯特氏菌属 o 单核增生李斯特氏菌生物学特性 o 流行病学 o 致病性 o 实验室危害及其预防 o 检测程序 o 快速检测方法 李斯特氏菌属 李斯特氏菌属（ Listeria ）普遍存在于环境中，最新的分类 学研究表明，其分为六个种： 单核增生李斯特氏菌（ Listeria monocytogenes） 绵羊（伊氏）李斯特氏菌（ Listeria ivanovii） 英诺克（无害）李斯特氏菌（ Listeria innocua） 斯氏李斯特氏菌（ Listeria seeligeri

2、） 威氏李斯特氏菌（ Listeria welshimeri） 格氏李斯特氏菌（ Listeria grayi） 在李斯特氏菌属的六个种中，只有两种致病菌： 单核增生 李斯特氏菌 和 伊氏李斯特氏菌 可以引起老鼠和其他动物发 病。但是，其中通常只有单核增生李斯特氏菌和人类的李 斯特氏菌症（ listeriosis）相关。因此，李斯特氏菌中最有检 测意义的是单核增生李斯特氏菌。 生物学特性 -菌体形态及染色特征 o 革兰氏 阳性 ； o 小的、类似球形 杆菌 ， 0.40.50.52m， 在有 些培养基中稍弯，两端钝圆，单个、成短链、细 胞彼此连成 V形，或成群的细胞沿长轴方向平行 排列，在较老

3、的或生长不良的培养物中，可能形 成丝状； o 20-25 周生 鞭毛 运动，在 37 只有较少的鞭毛 或 1根鞭毛； o 无芽孢、无荚膜。 生物学特性 -培养特性 o 兼性厌氧； o 在 20-25 培养有 动力 ，穿刺培养 2-5天可见倒立 伞状生长，肉汤培养物在显微镜下可见翻跟斗运 动。 o 生长温度范围为 2-42 （也有报道在 0 能缓慢 生长），最适培养温度为 30-37 。 o pH范围 pH4.4-pH9.6。 生物学特性 -培养特性 o 在固体培养基上，菌落初始很小，透明，边缘整 齐，呈露滴状，但随着菌落的增大，变得不透明 。 o 在 5-7%的血平板上，菌落通常也不大，灰白色

4、， 刺种血平板培养后可产生窄小的 -溶血环 。 o 在 0.6%酵母浸膏胰酪大豆琼脂 (TSAYE)琼脂上， 用 45角入射光照射菌落，通过解剖镜垂直观察 ，菌落呈兰色、灰色或兰灰色。 生物学特性 -生化反应 o 氧化酶 阴性。 o 能发酵多种糖类，产酸不产气，如发酵葡萄糖、 乳糖、水杨素、麦芽糖、 鼠李糖 、 七叶苷 、蔗糖 （迟发酵）、山梨醇、海藻糖、果糖，不发酵 木 糖 、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉 子糖、卫矛醇和纤维二糖。 o 不利用枸橼酸盐， 40%胆汁不溶解，吲哚、硫化 氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟 氨酸均阴性， VP、甲基红试验和精氨酸水解阳性 。 生物

5、学特性 -血清型 o 根据菌体（ O）抗原和鞭毛 (H)抗原，将单 增李氏菌分成 13个血清型，分别是 1/2a、 1/2b、 1/2c、 3a、 3b、 3c、 4a、 4b、 4ab、 4c、 4d、 4e 和 “7”。 o 致病菌株的血清型一般为 1/2b、 1/2c、 3a、 3b、 3c、 4a、 1/2a和 4b,后两型尤多。 生物学特性 -抵抗力 o 该菌对理化因素抵抗力较强，在土壤、粪便、青 储饲料和食品中能长期存活； o 对碱和盐抵抗力强， 60-70 经 5-20min可杀死， 70%酒精 5min、 2.5%石炭酸、 2.5%氢氧化钠、 2.5%福尔马林 20min 可杀

6、死此菌； o 湿热灭菌（ 121 ，至少 15min）和干热灭菌（ 160 -170 ，至少 1hr）可杀灭该菌，对紫外线和 射 线 敏感； o 该菌对青霉素、氨苄青霉素、四环素（已产生抗 性）、氨基糖苷类、氯霉素均敏感。 流行病学 o 分布 ：广泛存在于自然界中，土壤、地表 水、污水、废水、青储饲料、动植物及其 食品中均有该菌存在，所以动物很容易食 入该菌，并通过口腔 -粪便的途径进行传播 o 寄主范围 ：哺乳动物、鸟类、鱼类、甲壳 类和昆虫 流行病学 o 据报道，有 1-10%的人类肠道中存在单核增生李 斯特氏菌， 4-8%的水产品、 5-10%的奶及其产品 、 30%以上的肉制品及 15

7、%以上的家禽均被该菌 污染。 o 相关食品 ：鲜奶、巴氏消毒奶、奶酪（尤其是软 奶酪）、冰激凌、生的蔬菜、发酵过的生肉制作 的香肠、生的和加工过的禽肉、各种生的肉类、 生的和烟熏的鱼肉。约有 85-90%的病例是由被 污染的食品引起的。 致病性及其治疗 o 该病的临床表现，健康成人个体出现轻微类似流 感症状，新生儿、孕妇、免疫缺陷患者表现为呼 吸急促、呕吐、出血性皮疹、化脓性结膜炎、发 热、抽搐、昏迷、 自然流产或死婴 、脑膜炎、败 血症直至死亡。 o 由该菌造成的脑膜炎的致死率可高达 70%，败血 症的死亡率达 50%，围产期或新生儿感染的死亡 率超过 80%，怀孕期妇女的感染，母亲通常能存

8、 活下来。 o 抗生素治疗，用青霉素或氨苄青霉素注射给药， 或与氨基糖苷类抗生素一起用药。 感染人群 o 感染剂量未知，但与该菌的毒力和易感人群的年 龄、免疫状态有关。 o 易感者： 孕妇 /胎儿 围产期和新生儿的感染； 免疫缺损者； 癌症病人 尤其是白血病的患者； 年纪较大的人； 没有免疫缺陷的健康的人，食用污染该菌尤其是大量污染 该菌的食品后，也有患病的危险。 致病机理 o 单增李氏菌的抗原结构与毒力无关，它的致病性 与毒力机理如下： 1、寄生物介导的细胞内增生，使它附着及进入肠 细胞与巨噬细胞； 2、抗活化的巨噬细胞，单增李氏菌有细菌性过氧 化物歧化酶，使它能抗活化巨噬细胞内的过氧物 （

9、为杀菌的毒性游离基团）分解； 3、 溶血素 ，即李氏杆菌素 O，可以从培养物上清液 中获得，有 和 两种，为毒力因子。 实验室危害 o 不是一种普遍的与实验室相关的传染病， 目前只有少数有报道的案例发生； o 直接摄取 是最普遍的一种感染方式，除此 之外，暴露在该菌高浓度的气溶胶中，也 可通过眼睛和破损的皮肤、粘膜进入体内 造成感染。 注意事项 o 生物安全 2级 ，操作时应有相应的防污染设 施，在进行可能产生气溶胶的操作时，应 在生物安全柜内完成； o 在直接接触有感染性的材料时，必须穿着 实验服，戴手套和护目镜； o 怀孕的妇女 应避免接触传染物。 操作要求 o 溅洒 ：使气溶胶沉降，穿着

10、防护服装，用 纸巾轻轻覆盖溅洒处，加入 1%次氯酸钠 溶液，由周边向中心加，在清理之前要留 充足的接触时间（ 30min）； o 废弃 ：在废弃前应先采取净化措施，高压 蒸汽灭菌、化学消毒、焚烧等； o 储存 ：在有适当标记的密封容器内储存。 25g样品 +225ml FB1增菌液 30 25h1h 1mL转种 10mLFB2增菌液 30 25h1h VIDAS 快速筛选 阴性， 报告结果 阳性， 继续鉴定 选择性培养基（显色培养基、 OXA、 PALCAM） 挑选可疑菌落，接种 TSA-YE 35 24h 接种 TSB-YE 蓝 色 菌 落 检 验 典 型 运 动 检 验 过 氧 化 氢 酶

11、 试 验 革 兰 氏 染 色 溶 血 试 验 动 力 试 验 协 同 溶 血 试 验 血 清 学 试 验 报告结果 单核增生李斯特氏菌单核增生李斯特氏菌 检测流程检测流程 （ SN/T 0184.1- 2019） API鉴定试验或生化试验 尿素酶水解，硝酸盐还原 ，葡萄糖，甘露醇，麦芽 糖，鼠李糖，木糖，七叶 苷， TSI MR-VP 检测程序 -增菌 目前常用的单核增生李斯特氏菌检测增 菌肉汤主要有 半量 Fraser肉汤 、 Fraser肉汤 （ FB）、 UVM（ Modified University of Vermont broth，也叫 UVM1）、 LEB（ Listeria e

12、nrichment broth）和 BLEB（ buffered Listeria enrichment broth） 半量 Fraser肉汤和 Fraser肉汤 o 具有 选择性 和 区别性 。 o 加入 柠檬酸铁铵 和 七叶灵 ，起到区别的 作用。李斯特氏菌可以水解七叶灵，与 培养基中的铁离子反应，使培养基变黑 ，可直观的从培养液的颜色就可以判断 是否有单核李斯特氏菌的生长。 UVM o UVM只有选择性没有区别性 o 加入 萘啶酮酸 和 盐酸吖啶黄 ，作为选择性 因子。虽然其中含有七叶灵，但是没有添 加柠檬酸铁铵，不能发生黑色的颜色反应 。 LEB和 BLEB o 只有选择性没有区别性

13、o LEB是在 TSB-YE的基础上加入 盐酸吖啶黄 、 萘啶酮酸 和 放线菌酮 等选择性因子；加 入的 丙酮酸钠 ，有助于受损细胞的恢复； 不含七叶灵和柠檬酸铁铵，无颜色反应 o BLEB是在 LEB基础上加入缓冲体系：磷酸 二氢钾和磷酸氢二钠 检测程序 -分离 o 分离培养基有： OXA、 PALCOM、 LPM、 MOX 等。分离原理主要是基于李斯特氏菌具有 D 葡萄糖苷酶 的活性，能水解培养基中的七叶灵， 产生七叶苷，与铁离子产生颜色反应而使菌落为 棕褐色，并带有褐色晕圈，而致病性和非致病性 李斯特氏菌病都能发生这种反应 o 还有一些选择性显色培养基，如 BCM、 ALOA、 CHRO

14、Magar listeria、 RapidL. mono等，其原理 主要是检测由毒力基因编码的 溶血素 ，而此种溶 血素只存在于单核增生李斯特氏菌和伊氏李斯特 氏菌中，因而可以很好的将此两种菌同李斯特属 的其他种分开。 OXA平板 /(palcam) 单核增生李斯特氏单核增生李斯特氏 菌菌 ATCC 19117 48h， 35 培养培养 OXA平板 无害李斯特氏菌无害李斯特氏菌 ATCC 33090 48h， 35 培养培养 显色平板 检测程序 -鉴定 o 蓝色菌落检验（ Henry illumination） o 典型运动：相差显微镜，轻微旋转或翻跟头 动力试验： 7天，伞形生长 o 过氧化

15、氢酶 试验：阳性 o 革兰氏染色 ：阳性短杆菌 o 溶血试验 ：穿刺接种血平板 o 硝酸盐还原试验： 5天，阴性 o 糖发酵试验 ：葡萄糖、麦芽糖和七叶灵，李斯特 菌属反应均为阳性，除格氏李斯特甘露醇阴性， 李斯特其他种甘露醇阴性， 木糖 和 鼠李糖 最有检 测意义 动力试验 血平板 单核增生李斯特氏单核增生李斯特氏 菌菌 ATCC 19117 36h， 35 培养培养 血平板 无害李斯特氏菌无害李斯特氏菌 ATCC 33090 36h， 35 培养培养 血平板 伊氏李斯特氏菌伊氏李斯特氏菌 ATCC 19119 24h， 35 培养培养 单增李斯特菌 无害李斯特菌 绵羊李斯特菌 马红球菌 金

16、葡 协同溶血试验 单核增生李斯特氏菌检测流程单核增生李斯特氏菌检测流程 (GB/T4789.30-2019) 检样 25g(或 25mL)样品 +LB1增菌液 225mL，均质 0.1mL+10mL LB2增菌液 李斯特氏菌显色培养基 PALCAM琼脂 接种木糖、鼠李糖， 361 ， 24h；同时于 TSA-YE平板划线纯化， 30 1 ， 24h48h 木糖 -，鼠李糖 + 鉴定 结果报告 30 1 ， 24h 30 1 ， 1824h 36 1 ， 24h48h 单核增生李斯特氏菌检测流程 (FDA) 25g样品 +225ml BLEB基础（加入丙酮酸钠） 加入萘啶酮酸、盐酸吖锭黄、放线菌

17、酮 30 4hr 划线接种 OXA平板 30 24hr和 48hr 科玛嘉李氏菌显色培养基 TSA-YE分纯 35 24hr-48hr 35 24hr 过氧化氢酶试验、革兰氏染色、溶血试验、糖发 酵试验（木糖、鼠李糖） API Listeria 35 24-48hr 报告结果 35 18-24hr 方法名称 一次增菌 二次增菌 分离 鉴定 快速方法 SN 0184 - 1993 加 工 MBP 30 ， 18- 24h EB 30 ， 24/48h MMA/ OXA （ 35 ， 24-48h） 蓝色菌落；典型运动；过氧化氢酶； 革兰氏染色；溶血试验；尿素酶试验 ；硝酸盐还原； MR-VP；三

18、糖铁；糖 发酵；动力试验；协同溶血 *；血清 学检验 *；小鼠毒力试验 * 无 未 加 工 EB （ 30 ， 24/48h） GB/T 4789.30- 2019 EB （ 301 ， 48h） MMA （ 301 ， 24-48h ） 蓝色菌落；三糖铁；动力试验；染色 镜检（革兰氏染色、典型运动）；生 化特性（溶血反应、硝酸盐还原、尿 素酶、 MR-VP、糖发酵）；小鼠毒力 试验；协同溶血 无 LB1 （ 301 ， 24h） LB2 （ 301 ， 24h） FDA BLEB+Phy （ 30 ， 4h ） BLEB+Phy+ 三种抑菌剂 （ 30 ， 20/44h） OXA/PALOM

19、/MOX /LPM+七叶灵 +Fe3+ 推荐 BCM /ALOA / RapidLmono /CHROMagar Listeria 蓝色菌落 *；典型运动或动力试验； 过氧化氢酶；革兰氏染色；溶血试验 ；硝酸盐还原 *；糖发酵；协同溶血 ；血清学检验；小鼠毒力试验 * 筛选、鉴定都可以使 用快速方法 USDA UVM （ 302 ， 222h） FB （ 352 ， 26-482h） MOX （ 352 ， 26- 482h） 初步鉴定：纯菌菌落形态；典型运动 ； 生化鉴定： MICRO-ID Listeria或 Api Listeria或 BAM等方法中的传统 生化反应；协同溶血 遗传鉴定：

20、核糖体 RNA检测； PFGE* 筛选用的快速方法必 须经过确认后才可使 用 鉴定中用到 MICRO- ID 、 Api、 GenProbe AccuProbe 、 GENE-TRAK 各官方方法比较各官方方法比较 各官方方法比较各官方方法比较 方法名称 一次增菌 二次增菌 分离 鉴定 快速方法 CFIA MFHPB- 30 LEB（ UVM） （ 30 ， 24/48h） MFB （ 35 ， 24- 48h） OXA+LPM或 MOX或 PALCOM 典型运动或动力试验；溶血 试验；甘露醇；木糖；鼠李 糖；快速鉴定试剂盒 *；过氧 化氢酶 *；革兰氏染色 *；协 同溶血 *；血清学试验 *

21、 作为鉴定的可选 步骤，允许使用 快速方法，如 Vitek或 API、 Micro ID Listeria 、 Listera Accuprobe ISO 11290 -1:2019（ E） 半量 Fraser 肉汤 （ 30 ， 242h） Fraser肉汤 （ 35或 37 ， 482h） OXA和 PALCOM （ 30、 35或 37 ， 24-48h，） PALCOM平板 微需氧或好氧条 件培养 蓝色菌落 *；过氧化氢酶；革 兰氏染色；动力试验或典型 运动 *；溶血试验；糖发酵试 验；协同溶血；送参考实验 室（血清或噬菌体分型） 无 NMKL No.136 2nd 2019 LB （

22、 30.01.0 ， 243h） LB （ 30.01.0 ， 243h）或 Fraser肉汤（ 37.01.0 ， 484h） OXA和 PALCOM （ 37.01.0 ， 243/484h，好 氧或微需氧） 溶血试验；过氧化氢酶；革 兰氏染色；典型运动 动力试验；糖发酵试验；送 参考实验室（血清、噬菌体 、 DNA或酶分型） 允许使用经过确 认的商业化生产 的单核增生李斯 特氏菌菌株鉴定 试验，但没列明 具体试剂盒名称 单核增生李斯特氏菌检测快速方法 o VIDAS o VITEK o API Listeria o BAX o TECTA VIDAS LMO：单核增生李斯特：单核增生李斯特 VIDAS LIS：李斯特氏菌：李斯特氏菌 VIDAS API Listeria BAX TECRA UNIQUE PLUS TECRA UNIQUETM