1、慢性乙肝实验室检测及临床意义 刘怀祥 重庆骑士医院肝病科 贡献 1 血清酶检测 血清丙氨酸转氨酶 (alanine aminotransferase， ALT） ： 是目前临床上反映肝细胞功能的 最常用指标。急性肝炎时 ALT明显升高 ，黄疸出现后 ALT开始下降；慢性肝炎 和肝硬化时 ALT轻度或中度升高或反复 异常；重型肝炎患者可出现 ALT快速下 降，胆红素不断升高的酶、胆分离现象 ，提示肝细胞大量坏死。 1 血清酶检测 天门冬氨酸转氨酶 (asparate aminotransferase， AST) ： 特异性较 ALT低。此酶在心肌含量 最高，依次为肝、骨骼肌、肾、胰。在 肝病时血
2、清 AST升高，当病变持久且较 严重时，线粒体中 AST释放入血流，其 值可明显升高。急性肝炎时如果 AST持 续在高水平，有转为慢性肝炎的可能。 AST/ALT： 急性肝炎时 AST/ALT常小于 1，慢性 肝炎和肝硬化时 AST/ALT常大于 1。比值 越高，则预后愈差，病程中 AST/ALT比 值降低，提示未损及肝细胞线粒体，预 后较佳。 碱性磷酸酶： 当肝内或肝外胆汁排泄 受阻时，血清 ALP活性升高。 谷氨酰转肽酶： 肝炎和肝癌患者可 显著升高，在胆管阻塞的情况下更明显 ， -GT 活性变化与肝脏病理改变有良好 的一致性。 乳酸脱氢酶： 肝病时可显著升高。 胆碱酯酶： 其活性降低提示
3、肝细胞已 有较明显损伤，其值愈低，提示病情愈 重。 2 血清蛋白： 主要由白蛋白（ A）， 1， 2， 及 球蛋白组成。前 4种主要由肝细胞合 成， 球蛋白主要由浆细胞合成。在急 性肝炎时，由于白蛋白半衰期较长，约 21天，以及肝脏的代偿功能，血清蛋白 质和量可在正常范围内。慢性肝炎中度 以上、肝硬化、重型肝炎时出现白蛋白 下降， 球蛋白升高，白 /球（ A/G）比 例下降甚至倒置。 3 胆红素： 急性或慢性黄疸型肝炎时血清胆红 素升高，活动性肝硬化时亦可升高且消 退缓慢，重型肝炎常超过 171mol/L 。 一般情况下，肝损程度与胆红素含量呈 正相关。直接胆红素在总胆红素中的比 例尚可反映淤
4、胆的程度。 4 凝血酶原活动度（ PTA）： PTA高低与肝损程度成反比。 PTA40 是诊断重型肝炎的重要依据， PTA亦是 判断重型肝炎预后的敏感指标。 对照 -(对照 0.6) PTA= 100% 样本 -(对照 0.6) 5 血氨： 肝衰竭时清除氨的能力减退或 丧失，导致血氨升高，常见于重型 肝炎，肝性脑病患者。 6 血常规： 急性肝炎时白细胞稍低或正常 ，淋巴细胞相对增多，偶可见异 型淋巴细胞。重型肝炎时白细胞 可升高，红细胞下降，血红蛋白 下降。肝炎肝硬化伴脾功能亢进 者可有血小板、红细胞、白细胞 减少的 “三少 ”现象。 7 尿常规： 尿胆红素和尿胆原的检测是早 期发现肝炎的简易
5、有效方法，同时 有助于黄疸的鉴别诊断。肝细胞性 黄疸时两者均阳性，溶血性黄疸时 以尿胆原为主，梗阻性黄疸以尿胆 红素为主。妊娠急性脂肪肝患者尿 胆红素常阴性，有助于与妊娠急重 型肝炎鉴别。 8 电解质 重型肝炎常见低 K+、低 Na+，低 Cl-，亦可有低 Ca2+、低 Mg2+、低 P2- 等。肝肾综合征时可出现高 K+。 9 血糖 超过 40重型肝炎患者有血糖 降低，临床上应注意低血糖昏迷与 肝性脑病的鉴别。 10 血浆胆固醇 60-80的血浆胆固醇来自肝 脏，肝细胞严重损伤时，胆固醇 在肝内合成减少，故血浆胆固醇 明显下降，胆固醇愈低，预后愈 险恶。梗阻性黄疸时胆固醇升高 。 11 补体
6、 当肝细胞严重损害时，补体合成 减少。临床检测 CH50和 C3补体对预后 有评估作用。 12 甲胎蛋白（ AFP） HBV和 HCV感染与肝细胞癌（ HCC） 的发生有明显相关性， AFP含量的检 测是筛选和早期诊断 HCC的常规方法 。肝炎活动和肝细胞修复时 AFP有不 同程度的升高。应进行动态观察。急 性重型肝炎 AFP升时，提示有肝细胞 再生，为预后良好的标志。 13 胆汁酸 血清中胆汁酸含量很低，当肝 炎活动时胆汁酸升高。由于肝脏对 胆红素和胆汁酸的运转系统不同， 检测胆汁酸有助于鉴别胆汁淤积和 高胆红素血症。 14 肝纤维化指标 一些检测项目已在临床上应用 ，如 型前胶原肽、 型胶
7、原，层 连蛋白、透明质酸、脯氨酰羟化酶 等，对肝纤维化的诊断有一定参考 价值，但缺乏特异性。 15 影像学检查 B型超声波有助于鉴别阻塞性黄疸、 脂肪肝及肝内占位性病变。对肝硬化有 较高的诊断价值，能够反映肝脏表面变 化，门静脉、脑静脉直径，脾脏大小， 胆囊异常变化，腹水等。彩色超声波尚 未可观察到血流速度。在重性肝炎中可 动态观察肝脏大小变化等， CT的应用价 值基本同 B型超声波，但其有损伤性和价 值昂贵，如应用增强剂，可加重病情。 16 肝活检病理检查 其意义包括对病毒性肝炎作出 病理诊断，对不典型病例作出明确 判断，有助于治疗效果评价及观察 预后转归，还可从组织中检测病原 标志以明确感
8、染。 17 病原学检查 HBV 基 因 及 编 码 蛋 白 乙型肝炎 HBsAg与抗 HBs HBsAg在感染 HBV两周后即可阳性 。只要 HBsAg阳性就可诊断 HBV感染，阴 性则不能排除 HBV感染。 抗 HBs为保护性抗体，阳性表示对 HBV有免疫力。低滴度应注意假阳性。 乙型肝炎 HBsAg与抗 HBs HBV感染后可出现 HBsAg和抗 HBs同时阴性 ， 即所谓窗口期，此时 HBsAg已消失，抗 HBs仍 未产生，少部分病例始终不产生抗 HBs。 HBsAg和抗 HBs同时阳性 可出现在 HBV感染 恢复期，此时 HBsAg未消失，抗 HBs已产生； 另一情形是 S基因区发生变
9、异，野生株抗 HBs 不能将其清除；或抗 HBs阳性者感染了免疫逃 避株 HBsAg 常用 ELISA法检测。 目前 HBsAg诊断试剂质量较高， 灵敏度可达 0.2ng/L。从全国 室间质控评价结果显示，阳 性标本检出率达到或超过 98。 HBsAg滴度越高， HBeAg、 HBV DNA阳性的可能性越大。 血液与肝组织的 HBsAg含量并不完 全相关 HBsAg阳性就可诊断 HBV现症感染吗？ 为什么血清 HBsAg阴性不能排除 HBV感染？ 检测试剂不够敏感。 Abbott试剂盒由 ad亚型抗体和抗原制备， 对 ay亚型的灵敏度较低。 S基因变异（抗原性发生改变）。 X基因变异（转录受抑
10、制）。 重叠 HCV感染（干扰 HBsAg合成）。 HBsAg抗原性 aa124-147 HBsAg共同决定簇 “a” aa122 确定 HBsAg亚型 d/y， 赖氨酸 /精氨酸 aa160 确定 HBsAg亚型 w/r， 赖氨酸 /精氨酸 能导致 HBsAg阴性的 S区变异 aa124 半胱氨酸 酪氨酸 aa129 谷氨酸 天冬氨酸 aa131 苏氨酸 天冬氨酸 aa131 蛋氨酸 苏氨酸 aa122-124 插入氨基酸 前 S1/S2部分缺失 如何诊断血清 HBsAg阴性的 HBV感染？ 提高 检测敏感性 采用针对变异抗原的检测试剂 HBV DNA的检测 组织中标志物的检测 提高 检测
11、HBsAg敏感性方法 Aoki基于电子旋转共振技术的 HBsAg EIA方法，检测 HBsAg中稳定 的氮氧基因。在 30例 HBsAg阴性样 本中，检出 11例阳性。 抗 HBs阳性就万无一失了吗？ 低滴度应注意假阳性 单一抗 HBs阳性 HBV DNA检出率 0-11.8%： 先后感染了不同的 HBV亚型 S基因变异 X基因变异 抗 HBs阳性 HBV DNA阴性 并不排除肝细胞内 HBV的存在 HBsAg与抗 HBs共存 可出现在 HBV感染的恢复期，此时 HBsAg未消失，抗 HBs已产生，大部 分归功于检测敏感性的提高。 S基因发生变异，野生株抗 HBs不能将 其清除； 抗 HBs阳
12、性者感染了不同亚型 HBV或 免疫逃避株。 基因变异导致 HBsAg与抗 HBs共存 aa126 苏氨酸 丝、异亮氨酸 aa141 赖氨酸 谷氨酸 aa145 甘氨酸 精氨酸 前 S1 nt3025-3154缺失 乙型肝炎 HBeAg与抗 HBe HBeAg的存在表示病毒复制活跃且有 较强的传染性。 HBeAg消失而抗 HBe产生 称为血清转换。抗 HBe阳转后，病毒复制 多处于静止状态，传染性降低。长期抗 HBe阳性者并不代表病毒复制停止或无传 染性，研究显示 20% 50%仍可检测到 HBV DNA，部分可能由于前 C区基因变异，导 致不能形成 HBeAg。 HBeAg 是重要的免疫耐受因
13、子，大部分情 况下其存在表示患者处于高感染低 应答期。 HBeAg与 HBV DNA有良好的相关 性。 阳性标本检出率 90左右。 HBeAg水平与 HBV DNA的关系 HBeAg 134PEIU/L, HBV DNA 6.931.03e。 HBeAg 0.28 134PEIU/L, HBV DNA 5.581.84e 。 HBeAg阴性 /抗 HBe阳性 ， HBV DNA阳性 HBV感染是 否均由前 C区变异导致？ HBeAg阴性 /抗 HBe阳性， HBV DNA阳性 基因变异 HBV低水平复制 重叠 HCV感染 。 基因变异导致 HBeAg阴性 /抗 HBe阳性， HBV DNA阳性
14、 HBV感染 前 C区 1896位 G A，形成终止密码， HBeAg合成终止。 前 C区缺失或插入变异，改变 HBeAg 的抗原性，常规试剂检测阴性。 C区变异，导致 HBeAg的抗原性改变。 C基因启动子点突变或起始密码点突变 。 X区变异使 mRNA转录受抑制，导致 HBeAg合成减少，甚至难以检出。 HBeAg阴性 /抗 HBe阳性， HBV DNA 阳性 HBV感染 HBV DNA水平一般较低。 90% 以上由于 nt1896位突变引起。 多发生于 D型 HBV。 HBeAg与抗 HBe共存 血清转换过程中。 检测敏感性提高。 野生株与变异株同时存在。 乙型肝炎 HBcAg与抗 HB
15、c HBcAg阳性表示血清中存在 Dane颗粒， HBV处于复制状态，有传染性。 抗 HBc IgM是 HBV感染后较早出现的抗体，绝大多数出现在 发病第一周，多数在 6个月内消失。高滴度的 抗 HBc IgM对诊断急性乙型肝炎或慢性乙型肝 炎急性发作有帮助。 单一抗 HBc IgG阳性者可 以是过去感染，因其可长期存在；亦可以是 低水平感染，特别是高滴度者。 抗 HBc阴性的 HBV感染 免疫耐受。 检测试剂原因，目前试剂准确性 约 85% 。 C区突变。 检测 HBV-M水平有无意义？ HBsAg水平与 HBeAg及 HBV DNA 。 抗 HBs水平与是否注射疫苗。 HBeAg水平与 H
16、BV DNA。 与抗病毒治疗。 抗 HBc水平与现症感染。 血液中 HBV-M水平是否与肝组织中 HBV -M水平成正比关系？ 乙型肝炎 HBV DNA 病毒复制和传染性的直接标志。 HBV DNA 定量对于判断病毒复制程度，传染性大小， 病毒药物疗效等有重要意义。 HBV DNA检测方 面，还有前 C区变异、 S区变异和多聚酶基因 YMDD变异等检测。 HBV DNA拷贝数乙肝病毒载量 为什么建议每个病人都要进行 HBV DNA检测？ HBV DNA检测的临床意义 诊断方面： HBV DNA是 HBV存在最直接的依据 HBV DNA是 HBV复制的标志 HBV DNA是患者具有传染性的标志
17、HBV DNA检测的临床意义 对 HBV-M起补充作用： HBeAg()/ 抗 HBe() 乙型肝炎 （前 C区变异） HBsAg() 乙型肝炎 （ S区变异） 低水平感染 单项抗 HBc() 乙型肝炎 HBV DNA检测的临床意义 疗效判断： HBV DNA是目前判断乙肝抗病毒药 物疗效最敏感的指标 预后判断 HBV DNA水平与病情有一定的关系 HBV DNA检测的临床意义 调查表明并不是所有 “大三阳 ”的病 人都处于 HBV复制期，具有传染性； 也不是所有 “小三阳 ”的病人 HBV都无 复制。因此，要准确知道 HBV是否处 于复制状态，最准确的方法还是通过检 测 HBV DNA来决定
18、。 HBV DNA检测方法 斑点杂交（基本淘汰） 定性 PCR（基本淘汰） 定量 PCR（主流） 基因芯片（将来） HBV DNA检测方法的比较 斑点杂交 PCR 定量 PCR 敏感性 105 102 102 特异性 高 稍低 高 重复性 好 稍差 好 定量范围 4 6 6 简便 较繁琐 简便 简便 安全性 好 好 好 设备 便宜 稍贵 昂贵 技术要求 低 高 高 检测价格 低 中 高 基因芯片与 HBV DNA定量检测 HBV结果比较 基因芯片 阳性 阴性 阳性 19 4 HBV DNA定量 阴性 2 15 符合率为 85%(34/40)，芯片检出率为 82.61%(19/23), 假阳性率
19、为 11.76%(2/17). 基因芯片与 HCV RNA定量检测 HCV结果比较 基因芯片 阳性 阴性 阳性 7 5 HCV RNA定量 阴性 1 27 符合率为 85%(34/40)，芯片检出率为 58.33%(7/12), 假阳性率为 3.57%(1/28)。 基因芯片与错配 PCR检测 YMDD变异株结果比较 基因芯片 阴性 YMDD YVDD YIDD 混合 错 阴性 3 0 0 0 0 配 YMDD 1 3 1 1 2 PCR YVDD 1 2 5 0 0 YIDD 0 0 0 0 1 混合 0 0 0 0 0 5份芯片检测的标本与 DNA序列测定结果一致 为什么建议每个病人都要进
20、行 HBV DNA检测？ 从 HBV DNA与 HBV-M的关系中可得到解答 我科 1474例 HBV-M与 HBV DNA结果分析 HBsAg HBeAg HBcAb HBsAb HBeAb 例数 HBV DNA(+) 例数 (%) 1 + + + - - 603 520（ 86.2） 2 + - + - + 465 163（ 35.1） 3 + + - - - 19 18（ 94.2） 4 + - + - - 216 88（ 40.7） 5 + - - - + 5 3（ 60） 6 - - + + + 20 1（ 5） 7 - - + + - 27 1（ 3.7） 8 - - + - +
21、24 2（ 8.0） 9 - - - + + 1 0（ 0） 10 - - - + - 56 2（ 3.6） 11 - - + - - 26 3（ 11.5） 12 + + + + - 2 2（ 100） 13 - - - - - 10 0（ 0） 合计 1474 803 HBV-M与 HBV DNA关系 本科 四川 湖南 解放军 南方医院 “ 大三阳 ” 86.2 85.0 87.3 94.38 93.4 “小三阳 ” 35.1 20.3 25.6 27.3 83.8 “ 小二阳 ” 40.7 27.6 48.8 38.56 80.5 抗 HBc 11.5 10.8 39.3 抗 HBs 3
22、.6 0 9.7 0 三抗体阳 5.0 1.1 10.0 全阴 0 4.0 调查总例数 1474 2828 814 838 773 HBV DNA阳性率 HBsAg和 HBeAg均阳性而 HBV DNA阴性 可能有以下原因： (1) 干扰素或拉米夫定等治疗后病毒复制 受抑制。 (2) PCR所用引物相应的 DNA序列发生 突变，此引物与突变 DNA不能配对结 合。 (3) 病毒 DNA整合于宿主肝细胞染色体 而 血中游离 HBV DNA很少或缺乏。 乙型肝炎 组织中 HBV标志物的检测 可用免疫组织化学方法检测肝组织 中 HBsAg、 HBeAg的存在及分布；原位杂 交或原位 PCR方法检测组
23、织中 HBV DNA的 存在及分布。除可判定病毒是否处于复 制状态外，对血清中 HBV标志物阴性病人 的诊断有一定意义。 有关 YMDD变异株的检测 YMDD变异 YMDD 酪氨酸蛋氨酸天门冬 氨酸天门冬氨酸 。如发生 YMDD变异 ，则其 中的蛋氨酸（ M）突变为异亮氨 酸（ isoleucine， I）或缬氨酸（ valine ， V）形成 YIDD变异株或 YVDD变异株 。 YMDD位于 HBV多聚酶的关键功能区。 有关 YMDD变异株的检测 拉米夫定治疗后 HBV DNA复 阳是否均由 YMDD变异引起？ 如果是，不用检测 YMDD，只 需检测 HBV DNA即可。 有关 YMDD变
24、异株的检测 我科 7例出现耐药性的患者 中， 6例发现有 YMDD变异。提示 耐药性的发生主要是由于 YMDD变 异所造成，但可能存在 YMDD变异 以外的其他因素。 有关 YMDD变异株的检测 Alleb报道 20例拉米夫定治疗 后耐药病例，所有均存在 YMDD变 异。 Gane报道 8例拉米夫定治疗 后耐药病例，所有均存在 YMDD变 异。 有关 YMDD变异株的检测 自然条件下存在 YMDD变异株。 我科发现一例。 Kobayashi报道 18例 ALT正常 HBV无症状感染者中， 5例拉米夫 定治疗前为 YMDD变异株。 有关 YMDD变异株的检测 既然自然条件下存在 YMDD变 异株
25、，拉米夫定治疗前是否应进行 YMDD变异株的检测？ 有关 YMDD变异株的检测 YIDD可能是 YMDD 突变为 YVDD的中间产物，是否意味着检 测时应区分 YIDD变异株还是 YVDD 变异株？ 甲型肝炎 抗 HAV IgM： 在发病后数天即可阳性 ， 3 6月转阴。是早期诊断甲型肝炎最 简便而可靠的血清学标志。 抗 HAV IgG： 出现稍晚，于 2 3个月 达到高峰，持续多年或终身。抗 HAV IgG阳性表示受过 HAV感染。属于保护性 抗体，具有免疫力的标志。 丙型肝炎 抗 HCV IgM和抗 HCV IgG： HCV抗体不 是保护性抗体，是存在 HCV感染的标志 。抗 HCV Ig
26、M在发病后即可检测到，一 般持续 1 3个月。如果抗 HCV IgM持续 阳性，提示病毒持续复制，易转为慢性 。低滴度抗 HCV IgG提示病毒处于静止 状态，高滴度提示病毒复制活跃。 丙型肝炎 HCV RNA HCV RNA阳性是病毒感染和复制的直 接标志。 HCV RNA亦可定量，定量测定 有助于了解病毒复制程度、抗病毒治疗 的选择及疗效评估等。 有关丙型肝炎的病原检测 为什么要同时检测抗 HCV及 HCV RNA？ 抗病毒治疗的要求。 防止漏诊。 有关丙型肝炎的病原检测 有报道 223例丙型肝炎病例中， 抗 HCV和 HCV RNA同时阳性 86例，单 纯抗 HCV阳性 118例，单纯
27、HCV RNA 阳性 19例。 表明单做其中一项可能导致漏诊 。 丁型肝炎 HDAg、抗 HD IgM及抗 HD IgG HDAg阳性是诊断急性 HDV感染的直接证据。 HDAg在病程早期出现，持续时间平均为 21天。 抗 HD IgM阳性是现症感染的标志，当感染处 于 HDAg和抗 HD IgG之间的窗口期时，可仅有抗 HD IgM阳性。 抗 HD IgG亦非保护性抗体，高滴度提示感染 的持续存在，低滴度提示感染静止或终止。 有关丁型肝炎的病原检测 为什么丁肝三项一般不会同时阳性 ？ 有关丁型肝炎的病原检测 HDAg在病程早期出现，持续时间平均 为 21天，有相当一部分患者在急性期仅有 HD
28、Ag，无抗 HD存在，随着抗 HD的产生， HDAg多以免疫复合物形式存在，此时检测 HDAg为阴性。在慢性 HDV感染中，由于有 高滴度的抗 HD， HDAg多为阴性。当感染处 于 HDAg和抗 HD IgG之间的窗口期时，可仅 有抗 HD IgM阳性。 有关戊型肝炎的病原检测 抗 HEV IgM在发病初期产生， 大多数在 3个月内阴转。因此，阳性 是近期 HEV感染的标志。 有关戊型肝炎的病原检测 感染 HEV两周后， 97.8%病例抗 HEV IgG阳性， 1年后有 28.1%病例仍为 阳性，但滴度下降。 有关戊型肝炎的病原检测 为什么有必要进行抗 HEV IgG滴 度的检测？ 有关戊型肝炎的病原检测 目前较为一致的看法是抗 HEV IgG 在急性期滴度较高，恢复期则明显下降 。因此，如果抗 HEV IgG滴度较高，或 由阴性转为阳性，或由低滴度升为高滴 度，或由高滴度降至低滴度甚至阴转， 均可诊断为 HEV感染。 有关戊型肝炎的病原检测 少数戊型肝炎病人始终不 产生抗 HEV IgM和抗 HEV IgG， 两者均阴性时不能完全排除戊型 肝炎。 谢谢！
