1、选修 1 生物技术实践 第一部分 微生物的利用大肠杆菌的培养和分离学案 一、课标内容：进行微生物的分离和培养 二、教学要求： 基本要求 1， 进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进 行细菌培养的 操作。 2， 进行大肠杆菌的分离，用固体平面培养基进行细菌的划线培养。 发展要求 说明大肠杆菌培养的条件和实验原理。 说明 实验 2 和实验 3 不作要求。 三、知识要点： 1微生物是指结构 、形体 的 细胞、 细胞或 细胞结构 的 生物，如 。绝大 多数微生物与传染病无关，对人类 ，有多种用途。 2细菌是单细胞的 生物，从形态上分为 菌、 菌、 菌（弧菌） 。细 菌结构上，有 ，无 ，只有 一环状 。
2、有些细菌外有荚膜和鞭毛。有些细菌在不良的环境条件下，细胞 里 面形成一个椭圆形的休眠体，叫做 。当环境适宜时，休 眠体又可以萌发，形成一 个细菌。细菌繁殖方式: 繁殖，速度很快。单个细菌在固体培养基上大量繁殖 时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做 。他是 的重要依据。细菌在基因工程中应用广泛，可为其提供 载体，也可作为 细 胞。细菌用革兰氏染色法分为革兰氏 菌和 菌两大类，区别在 的成分不同。大肠杆菌是革兰氏 、 厌氧的肠道 菌。 3培养基按物理状态分： 培养基、 培养基、 培养基。其 中液体培养基常用于 ，半固体培养基可观察 微生物的 ，固体培养基用于 。细菌扩大培
3、养 要用 培养基，细菌分离要用 培养基。细菌的分离方法有两种： 和 。是消除 的通用方法，也是用于 高表达量菌株的最 简便方法之一。划线分离法，方法 ；涂布分离法，单菌落 ，但操 作 。不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方，细菌 ，霉菌 。 通常细菌培养基要用 和 提取物来配制，还要加入一定的 ，以维 持一定的渗透压；霉菌培养基一般用 配制或 豆芽汁即可。尽管培养 基的配方各不相同，但一般都含有 、 、 和 等营养物质。另 外还需要满足微生物生长对 、 、 等的要求。如细菌需要 环 境，霉菌需要 环境；厌氧生物需要控制 含量。有的还需要在培养基中 加入特殊营养物质。 4.在培养微生物时，必
4、须进行 。 （1）对实验操作空间、操作者的衣着和手进 行清洁和 ；（2）将培养器皿、接种用具和使用前和使用后的培养基等进行 ；（3）为避免周围微生物污染，实验操作应在超净台的 火焰附近旁进行；（4）避 免已灭菌处 理的材料用具与周围物品相接触。 常用的消毒方法： ，常用的灭菌方法： （1）灼烧灭菌，适用于 ；（ 2）干热灭菌 下 加热 ，适用于 ；（3） 灭菌：1kg/cm 2、 、 min 通常用于 ，如果各种器皿用此法灭菌，灭菌后放入 的烘 箱中烘干，再放到 ，打开 和过滤风，灭菌 min。 比较项 理化因素的作用强 度 消灭微生物的数量 芽孢和孢子能否被消灭 消毒 较为温和 大部分致病的
5、微生物 不能 灭菌 强烈 全部微生物 能 5.大肠杆菌的培养和分离实验操作 培养基的配置与灭菌 倒平板 注意事项 （1）培养基灭菌后，需要冷却到 左右时，才能用来倒平板 （2）灭菌及消毒：超净台用超净紫外灯和过滤风灭 菌；桌面及人手用 消毒 （3）操作时右手无名指和小指夹住封口膜,另外三指持三角瓶,左手拿培养皿并打开上盖的 一边,在 旁操作. （4）使锥形瓶通过 灼烧，再向培养皿倒入培养基 （5）倒入培养基后，立即将培养皿置于 ，并轻轻晃动，使培养基铺满底部形成 。 （6）平板冷凝后，要将平板 . （7）在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板不能 用来培养微生物
6、 大肠杆菌的扩大培养 注意事项: （1）在超净台的酒精灯火焰旁从斜面上用接种环取菌; （2）取菌前接种环要用酒精灯灼烧灭菌, 后方能取菌; （3）取菌后封口膜和棉塞复原. 大肠杆菌的划线分离 注意事项: （1）接种环只蘸 菌液 ,但要在培养基不同位置连续划线多次 .操作第一步、每次划 线之前及操作结束之后都需要 接种环。 （2）划线首尾 （3）划线后,培养皿 培养 1224h。 （是因为培养基中的水分会以水蒸气的形式 蒸发，倒放培养皿会使水蒸气凝结成水滴后，落入培养基的表面并且扩散，菌落中的细菌 也会随水扩散，菌落见相互影响，很难在分成单菌落，达不到分离的目的。 ） 涂布分离时，需要先将培养的
7、菌液 ，通常稀释到 10-510 -7之间，然后去 ml 不同稀释度的稀释菌液放在培养皿的 培养基上，用 涂布在培养基平 面上进行培养，在适当的稀释度下，可产生相互分开的菌落。通常每个培养皿中有 的单菌落为最合适。 大肠杆菌分离后保存 将每个菌落分别接种在斜面上，37培养 24 小时，菌落长成后置于 冰箱保存。 细菌的菌落表面一般是光滑而湿润的，有黏稠性，多数透明或半透明，但也有细菌的 菌落表面是干燥、有褶皱的；放线菌菌落表面是紧密的绒状、坚实多皱，长孢子后就成粉 末状，菌落培养基底部和菌落表面都有不同的颜色；酵母菌落类似于细菌菌落，表面光滑 而湿润，有黏稠性但大多呈乳白色，少数呈红色。 四、
8、练习反馈 1某学校打算开辟一块食用菌栽培 基地，以丰富学生的劳动技术课内容。首先对食 用菌实验室进行清扫和消毒处理，准备食用菌栽 培所需的各种原料和用具，然后从菌种站 购来各种食用菌菌种。请根据材料回答下列问题： 对买来的菌种要进行扩大培养，首先需要制备培养基，写出制备 LB 固体培养基所 需要的原料：蛋白胨、 、 、 和 。 微生物在生长过程中对各种成分所需量不同，配培养基时各成分要有合适的 。 在烧杯中加入琼脂后要不停地 ，防止琼脂糊底导致烧杯破裂。 将配好的培养基分装到试管中，加棉塞后若干个试管一捆，包上牛皮纸并用皮筋勒 紧放入 中灭菌，温度为 ，时间为 。灭菌完毕拔掉电源，待锅内 压力
9、自然降到 0 时，将试管取出。如果棉塞上沾有培养基，此试管应 。 从一支试管向另一支试管接种时注意，接种环要在酒精灯 焰灭菌，并且待接 种环 后蘸取菌种，试管口不能离开酒精灯火焰附近，将接种的试管在适温下培养，长 成菌落后放入 冰箱中保存。 2利 用微生物分解玉米淀粉生产糖浆，具有广阔的应用前景。但现有野生菌株对淀 粉的转换效率低，某同学尝试对其进行改造，以获得高效菌株。 实验步骤： 配置 （固体、半固体、液体）培养基，该培养基的碳源应为 。 将 接入已灭菌的培养基平板上。 立即用适当剂量的紫外线照射，其目的是 。 菌落形成后，加入碘液，观察菌落周围培养基的颜色变化和变化范围的大小。周围 出现
10、 现象的菌落即为初选菌落。 分离：将初选菌落向液体培养基中接种时应注意，接种环要在酒精灯 （内或外） 焰灭菌，并且待接种环 后蘸取菌种，防止细菌菌体死亡；菌体的分离可采用 法，出现 时标志着菌落已被分离。在无菌操作下，将单菌落用接种环取出， 接种到斜面上，适宜温度下培养一段时间，长成菌落后放入 冰箱中保存。 3回答下列有关细菌培养和分离的实验 在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑 、 和渗透 压等条件。由于该细菌具有体积小，结构简单、变异类型易选择、 、 等 优点，因此常作为遗传学研究的实验材料。 在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养皿进行 （消 毒、灭菌） ；
11、静止空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能 。 若在涂布分离法计数大肠杆菌活菌的个数，要想使所得估计值更接近实际值，除应 严格操作、多次重复外，还应保证待测样品稀释的 通常对获得的纯菌种还可以一句菌落的形状、大小等菌落特征对细菌进行初步的 。 培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对固体培养基应采用的检 测方法是 。 若用大肠杆菌进行实验，使用过的培养基及其培养物必须经过 处理后才 能丢弃，防止培养物的扩散。 4.某化工厂的污水池中，含有一种有害的、难于降解的有机化合物 A。研究人员用化 合物 A、磷酸盐、镁盐以及微量元素配制的培养基，成功地筛选到能高效降解化合物 A 的 细
12、菌（目的菌） 。实验的主要步骤如图所示。请分析回答问题： （1）培养基中加入化合物 A 的目的是筛选_，这种培养基属于选择培养基。 （2） “目的菌”生长所需的氮源和碳源是来自培养基中的_ _，实验需要振荡培 养，由此推测“目的菌”的代谢类型是_ （3）培养若干天后，应选择培养瓶中化合物 A 含量_的培养液，接入新的培养液中 连续培养，使“目的菌”的数量_。 （4）转为固体培养时，常采用_的方法接种，获得单菌落后继续筛选 （5）若研究“目的菌”的生长规律，将单个菌落 进行液体培养，可采用_的方法 进行计数，以时间为横坐标，以_为纵坐标，绘制生长曲线。 （6）实验结束后，使用过的培养基应该进行_处理后，才能倒掉
